《表1 TPP引物名称及序列》

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《沙葱萤叶甲海藻糖磷酸酶基因GdTPP的克隆、原核表达及对温度胁迫的响应》

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因沙葱萤叶甲TPP基因的中间片段序列包含3?末端，我们只设计5?特异性引物:TPP-5-F1，TPP-5-F2（表1）。利用这些引物进行TPP基因的5'-RACE扩增，以获得TPP基因的全长。采用SMART RACE说明书上的Touchdown PCR和Nest PCR方法进行5?-RACE。首先利用通用引物UPM和特异性引物TPP-5-F1所配成的50μL PCR反应体系进行Touchdown PCR，扩增条件为:94℃30 s，72℃2 min，5个循环；94℃30 s，70℃30 s，72℃2 min，5个循环；94℃30 s，68℃30 s，72℃2 min，25个循环。电泳检测后，取5μL PCR产物加入到Tricine-EDTA Buffer中配成模板，使用通用引物NUP和特异性引物TPP-5-F2进行Nest PCR，其扩增条件为:94℃预变性3 min；94℃30 s，68℃30 s，72℃2 min，25个循环；72℃延伸7 min。PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测、回收、连接、转化、测序，方法与1.3中间片段克隆方法一样。