《表1 PCR引物信息：单增李斯特菌溶血素S llsB基因缺失株的构建及部分生物学特性研究》

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《单增李斯特菌溶血素S llsB基因缺失株的构建及部分生物学特性研究》

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下划线处分别为BamHⅠ和KpnⅠ酶切位点The underlined sequences are BamHⅠand KpnⅠcleavage sites，respectively

以LM90菌株DNA为模板，用ΔllsB-A、ΔllsB-B和ΔllsB-C、ΔllsB-D引物，经PCR分别扩增llsB基因的上、下游同源臂。PCR反应体系20μL:2×PCR Mix 10μL，LM90DNA模板2μL，上、下游引物各1μL，ddH2O 6μL。PCR反应条件:94℃预变性5min；94℃变性30s，退火（退火温度见表1）30s，72℃延伸1min，共35个循环；72℃延伸10min。将PCR产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测并回收，以胶回收产物为模板，用引物ΔllsB-A、ΔllsB-D进行Overlap PCR扩增ΔllsB基因缺失融合片段。上、下游同源臂的PCR融合分两步进行，第1步不加引物，分别加入回收的上、下游同源臂、2×PCR Mix和ddH2O进行PCR扩增；第2步，在扩增后的产物中分别加入上游同源臂的上游引物（ΔllsB-A）和下游同源臂的下游引物（ΔllsB-D）继续进行PCR扩增。