《表1 引物序列：大腹园蛛梨状腺丝重组蛋白的表达纯化与纺丝》

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《大腹园蛛梨状腺丝重组蛋白的表达纯化与纺丝》

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注：从上至下实线部分序列分别为BamHⅠ、XhoⅠ、BsaⅠ与Esp3Ⅰ的识别序列。虚线部分序列GTA、GCT分别为Val密码子、Ala密码子。

以A.ventricosus PySp1重复单元DNA序列为模板，设计2对特异性引物（表1）。DNA片段经Bsa I与Esp3 I酶切后产生的粘性末端可互补配对且不含有内切酶的识别序列，可以实现无缝连接。5′GCT3′为PySp1重复单元的第一个氨基酸Ala的密码子；5′GTA3′为PySp1重复单元的最后一个氨基酸Val的密码子。在PySp1重复单元序列的5′与3′分别引入Val密码子、Ala密码子，以实现多重复单元的无缝连接（表1），两种密码子均简记为3 bp。PCR产物编号及对应的引物如表2所示。PCR体系为50μL:Q5 DNA polymerase 0.5μL；正反向引物各2.5μL；模板0.5μL；5×Q5 Reaction Buffer 10μL；2.5 mmol/L dNTPs 4μL，用ddH2O补齐至50μL。反应条件：98℃，30 s预变性，98℃，10 s变性；60℃，30 s退火；72℃，30 s延伸；72℃，120 s补平，4℃保存。最后对PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测。