《表1|RT-PCR引物序列》

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《转化生长因子β和骨形成蛋白2联合诱导小鼠成骨细胞系MC3T3-E1细胞的增殖与分化》

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RT-PCR具体步骤：（1）将PBS进行预冷，24孔板中加入适量Trizol试剂，反应期间缓慢旋转样板，使Trizol试剂充分接触细胞层进行消化。（2）RNA提取：（1）按操作说明方法将Trizol与氯仿体积比值为5∶1，猛烈摇晃均匀15 s后常温放置，将配置好的裂解液加入的24孔板中，每孔1 m L，裂解5 min；（2）将上述裂解后的样品4℃、12 000×g离心15 min，样品分为3层，RNA主要在无色水相中；（3）把无色水相液体小心吸取（宁少勿多）并转移到新无RNA酶EP管中，各加入1/2体积Trizol的异丙醇，轻轻混匀后-20℃静置2 h；（4）低温离心12 000×g，5 min促使RNA沉淀于EP管侧壁及管底，小心吸除上层液体；（5）加入1 m L体积分数75%的乙醇，7 500 r/min低温离心5 min，吸除上层乙醇；（6）样品室温下放置5-10 min干燥RNA沉淀，加入25μL RNA酶水溶解RNA酶，60℃恒温加热器加热10 min后迅速放置于冰箱中冷却；（7）测定RNA浓度，-80℃冰箱保存备用。（3）RNA反转录：按照c DNA反转录试剂盒说明书操作，将RNA反转录为c DNA，于-20℃保存。（4）PCR反应混合液的配置：将Real-time PCR引物与Mix相混合，吹打均匀，离心放置于冰上备用，再将无RNA酶水与2μL模板相混合，将混匀后的液体依次加入至八联管内备用。（5）设置Real-time PCR程序：95℃预变性10 s 1个循环，95℃（变性）15 s，58℃（退火和延伸）1 min 40个循环。（6）Real-time PCR引物设计：根据Gene Bank中Runx2、骨钙素基因序列，用Primer 6.0设计引物。