《表1 miR-374a引物及内参引物序列》

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《miR-374a对肺腺癌细胞增殖与侵袭迁移的影响》

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各组A549、H1975细胞总RNA提取采用Trizol法。除去6孔板中细胞培养液，每孔加PBS 1 ml洗涤细胞2次，每孔中加入Trizol 1 ml，反复吹打，室温静置5～10 min。随后收集6孔板中混合液吸取至1.5 ml EP管中，冰上静置2 min。按每1 ml Trizol加入0.2 ml氯仿，用振荡器振荡EP管15s左右，使氯仿和Trizol充分混合，冰上静置3～5 min，4℃，12 000 g离心15 min。取上清液，加入异丙醇0.5 ml，混匀后冰上静置10 min，4℃，12 000 g离心5 min。弃上清，取离心沉淀加入预冷的75%乙醇1 ml，吹打混匀后，4℃，7 500 g离心5 min。去上清，吸取残余酒精，超净台中风干，加入20～40μl DEPC水溶解RNA沉淀。用紫外分光光度仪测定总RNA浓度与纯度，A260/280在1.8～2.0。按照mRNA反转录试剂盒操作说明进行反转录，c DNA稀释至100μl置冰浴待用或-20℃保存。各样本逆转录产物c DNA需要量为2.0μl，利用SYBR Green I法[试剂盒SYBR Premix Ex Taq Kit （Takara）]在荧光定量PCR仪上行q PCR检测。反应程序:95℃10 s，95℃5 s，60℃20 s，40个循环，所有试验重复3次，采用相对定量分析按照2-（△△Ct(实验组）-△△CT（对照组）)求出各组细胞中miR-374a表达水平。miR-374a引物及内参引物均由上海捷瑞生物工程有限公司设计合成，见表1。