《表1 大型溞生殖和发育有关基因引物序列》

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《17β-雌二醇(E2)对大型溞(Daphnia magna)生殖、发育和相关基因转录的影响》

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21 d暴露结束后，每个暴露缸取10只溞，用TRIzol法提取总RNA，所提取的RNA用Epoch Microplate分光光度计（美国Bio Tek Instruments，Inc．公司）进行纯度检验。检验方法根据RNA样品在260 nm/280 nm波长下的比值，若比值在1.90～2.10之间，则确定所得RNA的纯度较高，可以用于反转录。RNA的浓度则根据260 nm波长下的吸光度数值确定，将所提取的RNA在200μL EP管中稀释至100 ng·L-1。反转录使用Prime Script RT reagent kits（中国Takara公司）试剂，所需RNA的量为500 ng。将反转录所需所有试剂配制为10μL体系，具体试剂用量如下:5×Prime Script Buffer（for real time）2μL、Prime Script RT Enzyme Mix 0.5μL、Oligo d T Primer（50μmol·L-1）0.5μL、Random 6 mers（100μmol·L-1）0.5μL、RNase Free d H2O 1.5μL和Total RNA 5μL。反转录体系加样完成后，经离心后放置在PCR仪中进行反转录。PCR仪反应条件设置如下:37℃，15 min；85℃，5 s。反应完成后得到c D-NA，在200μL EP管中加入RNase Free d H2O 90μL，c DNA被稀释10倍，均匀混合后置于-20℃中保存备用。qRT-PCR使用SYBR Green Primex Ex TaqⅡkits （中国Takara公司）试剂。根据SYBR Green Primex Ex TaqⅡkits试剂盒说明，配制20μL反应体系:SYBR Green Mix试剂10μL、DEPC水6μL、ROX Reference Dye试剂0.4μL、Primer F 0.8μL、Primer R 0.8μL和c DNA 2μL。将此20μL体系置于qRT-PCR专用96孔板中，每个浓度组设置3个平行，每个暴露缸中的10只溞混样为一个平行。qRT-PCR扩增条件设置为:95℃，2 min；95℃，15s；60℃，1 min；共计40个循环。数据采用CT值计算，采用2-△△CT法分析。实验所选取的与蜕皮和生殖有关基因选自相关文献的报道[28-33]，如表1所示。根据相关文献的研究，在雌激素物质暴露中，ubc的转录水平更为稳定[28]，因此本实验选定ubc为内参基因。