《表2 引物及PCR扩增条件》

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《宽体金线蛭的特异性PCR分子鉴定》

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各样本COI扩增体系为50μL，包含25μL 2×Gflex PCR Buffer（Mg2+，d NTP plus），引物COI1490和HCO2198各1μL 10μmol/L，1μL (5～150 ng）DNA模板，1.25 U Tks Gflex TM DNA Polymerase，加DEPC水补足至50μL。PCR反应结束后，向5μL扩增产物中加入1μL 6×Loading buffer（Takara公司），于含Du Red核酸染料的1%琼脂糖凝胶上进行电泳检测。检测扩增成功后，扩增产物40μL进行Sanger双端测序。一代测序工作由北京华大基因完成。测序数据经过在线BLAST鉴定结果，一代鉴定与传统鉴定结果一致。COI通用引物序列及扩增循环条件见表2。2.4 DNA模板浓度灵敏度考察及方法适用性考察选取K1组样品，将DNA模板浓度梯度稀释为25、5、1、0.2、0.04 ng。扩增反应体系25μL，包含2.5μL10×Fast Buffer I，2μL d NTP Mixture(2.5 mmol/L），引物sz97F和sz244R各0.5μL 10μmol/L，0.5μL(5～150 ng）DNA模板，0.625 U Speed STARTM HS DNA Polymerase，加DEPC水补足至25μL。PCR反应结束后，5μL反应产物中加入1μL 6×Loading buffer(Takara公司），混匀后于DU Red核酸染料染色的1.5%琼脂糖凝胶电泳。电泳结束后经凝胶成像系统成像、观察。扩增循环条件见表2。20份不同产地来源样品方法适用性考察的扩增体系、引物、循环条件及凝胶成像同上。然后向20μL扩增产物中加入0.5μL 10 000×SYBR Green I核酸染料于254 nm紫外灯下观察。