《表2 VIGS和半定量RT-PCR引物Table 2 Primer sequences of genes used in VIGS and semi-quan-titative RT-PCR ana

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《马铃薯双精氨酸转运系统基因TatA和TatB克隆及功能分析》

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通过SGN数据库，利用SGN VIGS Tool（http://vigs.solgenomics.net/）在线设计VIGS引物（表2）。以马铃薯c DNA文库为模板扩增Nb Tat A、Nb Tat B基因，PCR反应体系50.0μL包括Template Variable，10μmol/L Forward Primer 1.0μL，10μmol/L Reverse Primer 1.0μL，2×Taq PCR Master Mix 25.0μL。按照琼脂糖凝胶回收试剂盒中的产品说明操作，将目标片段割胶纯化。将上述PCR产物通过全式金生物公司开发的p EASY-Uni Seamless Cloning and Assembly Kit构建到p TRV2衍生的载体p YY13中，转化采用大肠杆菌Top10感受态，复苏和涂板。鉴定阳性菌落测序。用生物信息学软件对测序结果进行分析。将测序正确的大肠杆菌重组载体Nb Tat A-TOP10、Nb Tat B-TOP10在帮助菌HB101的作用下，通过菌毛的结合作用，通过三亲本融合的方法导入农杆菌GV3101。注射不大于60日龄的本生烟草。以Nb PDS VIGS作为正对照，农杆菌注射2周后或PDS正对照叶片白化出现后，观察植物发育表型的变化。