《表1 本研究使用引物：新疆伊犁州蝙蝠的病毒宏基因组学研究》

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《新疆伊犁州蝙蝠的病毒宏基因组学研究》

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根据病毒宏基因组注释结果，挑选冠状病毒、星状病毒、副肠孤病毒、圆环病毒进行套式PCR检测。冠状病毒、星状病毒和圆环病毒的PCR检测方法为本实验室之前所建立[8，9]，副肠孤病毒根据reads拼接成的重叠序列（contigs），利用Premier Primer5.0设计引物，扩增待鉴定的病毒序列，所有引物序列见表1。使用DNA和RNA提取试剂盒（德国Qiagen公司）对蝙蝠组织（肺脏和肠道）单样进行DNA和RNA提取，提取方法参考试剂盒说明书；得到的RNA使用反转录试剂盒（TaKaRa）反转录为cDNA，连同DNA进行不同病毒的PCR检测。PCR反应体系均为25μl:2×MasterMix（Tiangen）12.5μl、ddH2O 9.5μl、上游引物1μl、下游引物1μl、模板1μl，PCR通用程序为94℃预变性3min，94℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸40s，其中内套30个循环，外套35个循环，不同病毒的退火温度根据Tm值进行适当调整。PCR产物经含浓度为万分之一Super GelRed核酸染料（US EverbrightInc.）的1%琼脂糖凝胶电泳鉴定为阳性后，送吉林库美基因公司测序。