《表1 野生秦岭羚牛产甲烷古菌16S rRNA序列比对结果》

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《野生秦岭羚牛瘤胃产甲烷古菌多样性研究》

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挑取阳性克隆子用p MD19-TVector载体通用引物M13-47和M13-48对插入片段进行菌落PCR扩增，PCR产物电泳检测对目标插入片段进一步进行验证。菌落PCR体系（20μL）:2×Taq Master Mix10μL，上、下游引物各1.5μL，dd H2O 6μL，菌液1μL。菌落PCR反应程序:95℃5 min；94℃1 min，58℃1 min，72℃1.5 min，共34个循环；72℃10 min。利用限制性内切酶HaeⅢ对菌落PCR产物于37℃下酶切4 h，酶切体系（20μL）如下:10×Buffer 2μL、HaeⅢ1μL、PCR产物5μL、dd H2O12μL。酶切产物用1.5%的琼脂糖凝胶电泳进行检测。酶切图谱用Quantity One软件进行分析，选取酶切带型不同的代表克隆对应的菌液送至生工生物工程（上海）股份有限公司，进行测通测序。将HaeⅢ酶带谱切分析不同且测序结果也不同的克隆归为1个OTUs。克隆文库覆盖率计算公式如下:C=[1-（n/N）]×100%[12]。式中，n代表在16S rRNA克隆文库仅出现一次的OTU数量，N代表16S rRNA克隆文库的总数。