《表1 插入片段引物序列：冠心病相关SLC22A3基因中新发现负性调控序列的性质与功能鉴定》

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《冠心病相关SLC22A3基因中新发现负性调控序列的性质与功能鉴定》

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注：下划线所示部分为同源臂；SLCi7-447-X、SLCi7-460-X同源臂针对经XbaⅠ线性化的p GL3-Control质粒；SLCi7-447-S、SLCi7-460-S同源臂针对经SalⅠ线性化的p GL3-Control质粒

所需构建的重组质粒关键区域如图1所示，为了保证目的片段插入方向，载体的构建采用同源重组的方法，将上、下游引物的5’端分别加入工具酶（上游选用XbaⅠ，下游选用SalⅠ）及该酶切位点前后约15个碱基的载体序列作为同源臂（表1）。以含有人SLC22A3基因全长序列的BAC为模板，PCR扩增2段负性调控序列，产物分别为SLCi7-447-X、SLCi7-447-S、SLCi7-460-X及SLCi7-460-S。PCR反应体系：总共50μL，模板2μL，上下游引物各1μL，10×Buffer 5μL，2.5mmol/L dNTPs 4μL，Trans Taq HiFi DNA Polymerase（5 U/μL）0.5μL，ddH2O 36.5μL。反应条件：94℃2 min；94℃30 s，58℃30 s，72℃30 s，30个循环；72℃5 min。所获产物经1%琼脂糖凝胶电泳（110 V，25 min），确认为所需片段后，利用PCR产物纯化试剂盒纯化回收。质粒pGL3-Control分别用XbaⅠ及SalⅠ酶切试剂盒纯化回收得到线性质粒pGL3-Control-X及pGL3-Control-S。pGL3-Control-X分别与SLCi7-447-X、SLCi7-460-X，pGL3-Control-S分别与SLCi7-447-S、SLCi7-460-S在ExoⅢ外切酶的作用下，在冰上进行同源重组60 min。利用DH5α大肠杆菌感受态进行同源重组产物的转化，并行氨苄青霉素（ampicillin，Amp）抗性筛选；提取质粒，进行酶切鉴定后送测序获得重组质粒pGL3-con-SLCi7-447X、pGL3-con-SLCi7-447S、pGL3-con-SLCi7-460X及pGL3-conSLCi7-460S。