《表1 引物信息Tab.1 Primer sequence information》

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《弱精子症患者精子中DKKL1的表达》

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按照逆转录试剂盒操作说明合成c DNA第一条链，用该c DNA为模板，GAPDH为内参，用相应引物对其进Real-time PCR，引物由Invitrogen life technology公司合成（表1），整个实验操作流程在ABI7500荧光定量PCR仪上进行。PCR反应体系共20μL，按照德国DBI试剂盒的要求在冰上操作:上游引物（20μmol/L）0.2μL，下游引物（20μmol/L）0.2μL，c DNA（500 ng/20μL）5μL，50×ROX 0.04μL，Bestar?Sybr Greenq PCRmastermix10μL，DEPC-treated water 4.56μL。反应条件采用3步法:95℃预变性3 min，95℃变性10 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，完成35个循环。每个样本3个复孔，取Ct的平均值。本研究采用2-△△ct相对定量来检测DK-KL1 m RNA在正常精液精子和弱精子症精液精子的表达差异。△Ct值=待测基因Ct值-内参基因Ct值，△△Ct=实验组目的基因△Ct值-对照组目的基因△Ct值。以Fold-change=2-△△ct表示弱精子症和正常精液精子中DKKL1 m RNA的倍比关系。