《表1 沙葱萤叶甲GdJHBP的克隆与RT-qPCR检测引物信息》

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《沙葱萤叶甲保幼激素结合蛋白基因GdJHBP的克隆及表达分析》

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以测序验证获得的GdJHBP中间片段序列为模板，根据TaKaRa 5'-3'RACE试剂盒说明书分别设计5￠GSP引物进行降落PCR和3'NGSP引物进行巢式PCR（表1）。5'RACE第一轮反应条件：变性（94℃30 s），延伸（72℃3 min），循环5次；变性（94℃30 s），退火（70℃30 s），延伸（72℃3 min）循环5次；变性（94℃30 s），退火（68℃30 s），延伸（72℃3 min）循环25次；以稀释20倍的第一轮反应产物为模板，进行二次PCR，反应条件：变性（94℃30 s），退火（68℃30 s），延伸（72℃3 min）循环25次。3'RACE与上述条件相同。扩增后的PCR产物经回收及亚克隆后，送北京六合华大测序。验证所得5'和3'序列信息后，利用Vector NTI11.5将中间片段、5'和3'拼接获得GdJHBP基因完整的cDNA序列。