《表3 基因特异性crRNAs及用于重组的单链寡核苷酸》

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《"耻垢分枝杆菌中3-甾酮-Δ~1-脱氢酶对植物甾醇转化积累9α-羟基雄甾-4-烯-3,17-二酮的影响"》

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斜体：单链寡核苷酸中引入的2个连续终止密码子taataa用于终止靶基因表达.

本研究采用CRISPR-Cas12a辅助重组工程[27]构建Msm1菌株.首先在kst D1基因上选取靶向滞后链的31个碱基序列作为基因特异性cr RNA（表3），以p CR-Hyg质粒为模板，用Kst D1-F/R和p CR-Hyg-F/R（表2）两对引物扩增（图2），得到的两个质粒片段连接并转化后送测序（引物用p CR-cexu），测序正确的抽提得到重组质粒p CR-Hyg-kst D1.与此同时，合成60 bp用于重组的ss DNA-kst D1（包含31 bp cr RN A），并引入两个连续终止密码子（TAATAA）用于终止目标基因的表达（表3）.然后将约100ng cr RNA重组质粒p CR-Hyg-kst D1和500 ng ss DNA-kst D1转化到已表达Cas12a和重组酶的M.smegmatis mc2155中，引物Kst D1-PCR-F/R进行PCR验证后测序可得到重组菌株.最后，在添加了1%蔗糖的LB培养基中培养细胞获得了无抗性质粒的Msm1菌株.