《表1 本研究所用引物序列》

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《三疣梭子蟹C-JUN氨基末端激酶基因克隆及在病原胁迫后的表达特征分析》

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根据三疣梭子蟹转录组数据库筛选得到PtJNK的EST序列，利用Primer Premier 5.0软件设计3′和5′RACE特异性引物及通用引物，由生工生物工程（上海）有限公司合成（表1），使用Trans Taq?DNA高保真聚合酶（北京全式金生物公司）进行3′和5′末端巢式PCR扩增，第1轮使用UPM通用引物，10μl反应体系：0.5μl模板、0.4μl Forward/Reverse Primer（10μmol/L）、5μl Premix Taq（LA Taq Ver 2.0）、dd H2O补足；程序：94℃5 min；94℃30 s，60℃30 s，72℃1.5 min，35个循环；72℃10 min。第2轮以第1轮反应为模板，使用NUP通用引物，20?l反应体系，程序：94℃5min；94℃30 s，60℃30 s，72℃1.5 min，35个循环；72℃10 min。将获得的PCR产物使用1%琼脂糖凝胶电泳检测，将检测合理的目的条带进行切胶回收（TaKaRa Mini BEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0），与pMD-18T载体（TaKaRa）连接3 h，转化至DH5α大肠杆菌感受态细胞（TSINGKE）中，涂布于含氨苄的固体培养基上，37℃恒温过夜培养，挑取阳性单克隆，加入含100μg/ml氨苄的LB液体培养基中，37℃200 r/min振荡培养4 h，用M13-47/48引物进行菌落PCR鉴定，并将检测准确的目的菌液送至生工生物工程（上海）有限公司进行测序。