《表1 引物序列：miR-138介导ERK和AKT对NSCLC细胞株A549增殖和迁移的作用机制研究》

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《miR-138介导ERK和AKT对NSCLC细胞株A549增殖和迁移的作用机制研究》

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2.研究方法:（1）细胞培养传代:取NSCLC细胞株A549接种培养，初次接种细胞呈圆形，悬浮状态，1d后逐渐贴壁，2d后完全贴壁细胞梭形或多边形，7d后细胞密度生长至80%～90%，传代培养弃去培养液，0.25%胰蛋白酶消化，吸管吹打，制作细胞悬液，移植新培养瓶中，继续培养收集第5代细胞，将A549细胞稀释至1×105/ml，平铺到16孔板中，待A549细胞密度生长为60%～80%时进行转染。（2）细胞转染和分组:将稀释的A549细胞加入培养皿中进行转染，按Lipofectamine2000说明书操作进行。将A549细胞分成Az、Am和Ay三组，Az组A549细胞转染空载体，Am组转染miR-138-mimics，Ay组转染miR-138-inhibitions，转染4h，弃上层液体，更换培养基，培养48h。（3）用RT-PCR检测miR-138、ERK和AKT mRNA水平变化:A549细胞总RNA采用Trizol法提取，总RNA提取反转录成cDNA，按全说明书实验，用DNA荧光染料SYBR GreenⅠ对ERK和AKT表达水平进行检测，内参采用U6，60℃，10 min、95℃和72℃，各30 s和95℃，5 min，循环40次为准，实验至少3次，用相对定量2-ΔΔCT计算ERK、AKT和miR-138水平，见表1。（4）采用Westernblot法检测ERK和AKT蛋白表达:在6孔板中加入100μg胰蛋白酶提取液，注入2ml培养基，转染后的细胞放入EP管中，并与胰蛋白酶提取液按1:100混合，放入冰箱冷冻10min，细胞完全裂变，成为E溶液；在EP管中按1:100加入胰蛋白酶提取液2ml，使细胞完全裂变为F溶液，E和F溶液以80:1摇匀，配制成工作液，放入37.5℃保温箱中20min，冷却后计算ERK和AKT蛋白浓度。（5）用流式细胞仪检测A549细胞凋亡程度:处理后的细胞放置于PBS溶液中，洗涤2次，离心5min，选择100μl的1×结合缓冲液，进行重悬细胞操作，用5μl标记l FITC的AnnexinⅤ与5μl PI染色混匀，避光孵育15min后，加入400μl的1×结合缓冲液混匀，洗涤3次，检测细胞凋亡情况。（6）Transwell检测A549细胞迁移能力:将3组细胞进行饥饿处理，12h后再加入DMSO，24h后离心重悬细胞5×105/ml，准备Transwell小室注入200ml细胞悬液，置入培养基中培养12h，培养结束可上室，拭去为迁移细胞，无水甲醛固定8min，染色用结晶紫溶液，显微镜（×100）观察。（7）MTT检测A549细胞增殖能力:离心经处理后的A549细胞3～5min，将细胞接种在96孔板上培养，每孔200μl，室温37℃、5%CO，培养>24h，≤72 h，加入MTT培养不少于3h，与150μl的DMSO溶液混匀，酶标仪测定光密度（OD490），分析细胞活力变化情况。