《表2 近五年利用黑曲霉表达异源重组蛋白的实例》

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《利用黑曲霉高效表达外源蛋白策略》

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黑曲霉Aspergillus niger属于子囊菌亚门、丛梗孢科、曲霉属真菌的常见种，也是自然界中最为常见的丝状真菌，在植物性产品、粮食和土壤中广泛分布。其分生孢子头为黑褐色放射状，球状顶囊，分生孢子梗长短不一，菌丝发达，多分支。黑曲霉能够通过降解自然界中的有机质并吸收其中的营养物质而快速生长。由于黑曲霉能够产生酶制剂和有机酸，因而成为重要的工业生产菌株（表1，2）。James Currie利用黑曲霉首次发明了柠檬酸的工业生产方式，研究了柠檬酸合成所必需的生长培养基，并介绍了黑曲霉作为有机酸工业生产菌株的优越性[1]。2007年，全球柠檬酸产量达到160万t，2014年估计价值为26亿美元，预计到2020年将增加到36亿美元[2]。目前柠檬酸主要产自我国，约占全球产量的60%[3]。黑曲霉的工业应用不仅限于柠檬酸的生产，许多工业相关的酶和其他分子都由该种真菌生产。目前利用黑曲霉生产的商业酶制剂包括食品、洗涤、纺织和造纸等工业中用到的淀粉酶、葡萄糖氧化酶、过氧化氢酶、纤维素酶、果胶酶、蛋白酶、植酸酶和木聚糖酶等，通过其表达的异源蛋白有溶菌酶[4]、白细胞介素-6[5]、人乳铁蛋白[6]、牛凝乳酶[7]、奇异果甜蛋白[8]、脂肪酶[9]等。由于曲霉菌在食品生产中具有悠久而安全的历史，因此被列为“Generally Regarded As Safe”菌株。因此，由黑曲霉生产的产品比其他未经批准的菌株生产的产品更容易令人接受。黑曲霉作为外源蛋白的表达系统具有优越于大肠杆菌Escherichia coli和酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae系统的独特优点。大肠杆菌会产生内毒素，同时在高表达外源蛋白时容易产生包涵体，且缺少一些真核细胞的翻译后修饰机制，导致其应用受到了很大限制。酿酒酵母分泌蛋白的能力较弱，且往往产生O-糖基化[10]。相比之下，黑曲霉与哺乳动物细胞更为接近，而且具有很强的外泌蛋白能力，并能对合成的真核蛋白进行正确的翻译后加工，包括肽链的剪切、糖基化修饰和二硫键的形成等。虽然黑曲霉用于商业化生产外源蛋白已经有很长的历史，但大多数外源蛋白的高效表达依旧比较困难。近年来，通过选用强启动子、增加基因拷贝数、使用蛋白酶缺陷菌株、采用基因融合、增加糖基化等策略来增强黑曲霉外源蛋白的重组表达量取得了很好的进展，而对黑曲霉基因组、转录组以及蛋白组学的研究，更为靶向改造黑曲霉并利用其高效表达异源蛋白创造了条件。