《表1 蓝玉簪龙胆ITS序列PCR扩增采用的扩增体系与扩增程序》

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《蓝玉簪龙胆ITS序列克隆与遗传分化分析》

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通过CTAB法[5]从干燥的植物叶片中提取总DNA，用1%琼脂糖检测提取质量。选用通用的ITS1a-ITS4引物[6]，扩增体系和扩增反应见表1。将PCR产物用EZ-10柱式胶回收试剂盒（Omega，广州）回收纯化，1%琼脂糖电泳检测，用分光光度计NanoDrop 2000（Thermo Scientific）测定浓度后，进行p MD18-T载体（Takara，大连）在16℃连接4h，5ul反应体系为:载体50ng，PCR纯化产物20ng，Solution I1.0ul。连接后的产物与E.coli DH5α感受态细胞（Takara，大连）感受态细胞按说明书进行标准的转化程序，随后在平板上做蓝白斑筛选，37℃过夜培养。挑取阳性单克隆在LB培养基中培养3～5h后对菌液做PCR检测，反应体系和扩增程序见表1。将阳性克隆摇菌，用EZ-200柱式试剂盒（生工，上海）提取质粒，用BigDye v3.1（Applied Biosystems，USA）和ABI3730xl（Applied Biosystems，USA）测序。