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中译本序1

第一章质粒载体1

第一节 质粒的基本特性1

（一）复制能力和不相容性1

译者的话3

（二）转移性3

（三）选择标记4

第二节质粒载体5

一、质粒克隆载体的发展5

（一）可用组织化学方法鉴定重组克隆的质粒载体6

（二）带有单链噬菌体复制起点的质粒载体6

二、通常使用的质粒载体7

（五）质粒表达载体7

（四）可对重组克隆进行正选择的质粒载体7

（三）带有噬菌体启动子的质粒载体7

第二版前言7

1.pBR3228

2.pUC18、pUC198

鸣谢9

3.pUC118、pUC1199

4.pSP64、pSP65、pGEM-3、pGEM-3Z、pGEM-3Zf(-)、pGEM-4、pGEM-4z10

第一版前言11

5.πN1315

6.BluescriptM13+、M13-15

第三节 质粒DNA的提取和纯化16

一、导论16

（一）细菌培养物的生长17

（二）细菌的收获和裂解17

（三）质粒DNA的纯化18

2．碱裂解法19

1．收获19

二、质粒DNA的小量制备19

（一）细菌的收获和裂解19

3．煮沸裂解22

（二）质粒DNA小量制备的问题与对策23

（三）细菌菌落的快速裂解及质粒大小的检查23

三、质粒DNA的大量制备24

（一）在丰富培养基中扩增质粒24

（二）细菌的收获和裂解24

1．收获24

2．煮沸裂解法25

3．SDS裂解法25

4．碱裂解法26

（二）氯化绝-溴化乙锭梯度平衡离心法纯化闭环DNA28

1．连续梯度28

四、质粒DNA的纯化28

（一）聚乙二醇沉淀法纯化质粒DNA28

2．不连续梯度30

（三）从经过纯化的质粒DNA中去除溴化乙锭31

1．方法Ⅰ：有机溶剂抽提31

2．方法Ⅱ：离子交换层析31

（四）溴化乙锭溶液的净化处理32

1．溴化乙锭浓溶液（即浓度＞0.5mg/ml的溴化乙锭溶液）的净化处理32

（五）从质粒DNA制品中去除RNA33

2．溴化乙锭稀溶液（如含有0.5μg/ml溴化乙锭的电泳缓冲液）的净化处理33

1．通过1mol/L Nacl进行离心34

2．通过Bio-Gel A-150m或Sepharose-CL 4B进行层析34

第四节 在质粒载体中进行克隆的策略34

一、连接反应的策略35

（一）外源DNA片段末端的性质35

1．带有非互补突出端的片段35

2．带有相同末端（平端或粘端）的片段37

（一）去磷酸化40

二、线状质粒DNA的去磷酸化40

3．带有平端的片段40

（二）质粒载体和外源DNA中限制酶切位点的性质40

（二）连接预试验和转化41

三、连接反应42

（一）外源DNA和质粒载体的连接反应42

（二）粘端连接46

（三）平端DNA连接47

1．凝聚剂47

（四）质粒载体中的快速克隆48

第五节 大肠杆菌感受态细胞的制备和转化49

（一）高压电穿孔法转化大肠杆菌（电转化法）50

（二）方案一：制备新鲜或冷冻的大肠杆菌感受态细胞50

（三）方案二：用氯化钙制备新鲜的大肠杆菌感受态细胞55

第六节 含重组质粒的细菌菌落的鉴定56

（一）α互补现象的检查57

一、小规模制备质粒DNA进行限制酶切分析57

二、α互补57

三、插入失活60

四、杂交筛选60

（一）将少数菌落转移到硝酸纤维素滤膜上61

（二）将菌落影印在硝酸纤维素滤膜上62

1．方法Ⅰ62

2．方法Ⅱ64

（三）菌落的裂解及DNA结合于硝酸纤维素滤膜65

1．方法Ⅰ65

2．方法Ⅱ65

（四）与菌落的影印滤膜进行杂交66

参考文献69

（一）吸附75

一、裂解周期75

第一节 λ噬菌体的分子生物学75

第二章λ噬菌体载体75

（二）立即早期转录77

（三）延迟早期转录77

（四）DNA复制77

（五）晚期转录77

（六）噬菌体的组装79

（七）裂解80

二、溶源状态80

第二节 λ噬菌体载体80

一、λ噬菌体载体的构建简史80

二、选择适当的λ噬菌体载体81

三、λ噬菌体载体的图谱84

（一）Gharon 4A Charon 21A、Charon 32-35 和Charon 40载体84

1．Charon 4A86

2．Charon 21A 载体88

3．Charon 32载体90

4．Charon 33载体92

5．Charon 34和Charon 35载体94

6．Charon 40载体98

（二）EMBL3、EMBL4和EMBL3A载体100

（三）λ2001、λDASH和λFIX载体102

1．λ2001载体102

2．λDASH和λFIX载体104

（四）λgt10载体108

（五）λgt11和λgt18-23载体系列108

1．λgt11载体110

2．λgt18和λgt19载体112

3．λgt20和λgt21载体114

4．λgt22和λgt23载体116

（六）λORF8载体118

（七）λZAP载体120

1．λZAP/R载体122

四、选择适于λ噬菌体载体的宿主123

（一）限制与修饰123

（二）琥珀突变抑制基因123

（三）重组系统123

1．沉淀噬菌体颗粒126

第三节 λ噬菌体的培养、纯化和DNA提取127

一、λ噬菌体的噬斑纯化127

（一）铺平板细菌的制备127

（二）λ噬菌体的铺平板培养127

（三）挑取λ噬菌体噬斑128

二、从单斑制备λ噬菌体原种129

（一）平板裂解物原种129

1．平板表解物原种的制备：方法Ⅰ129

2．平板裂解物原种的制备：方法Ⅱ130

（二）小规模液体培养131

（三）λ噬菌体原种的长期贮存131

三、λ噬菌体的大规模制备132

1．低复数感染法132

2．高复数感染法133

四、λ噬菌体的纯化133

（一）λ噬菌体纯化的标准方法133

（二）λ噬菌体纯化的其他方法136

2．甘油分级梯度离心136

3．氯化绝平衡离心137

五、λ噬菌体DNA的提取137

第四节 用λ噬菌体进行克隆138

一、载体DNA的制备138

（一）λ噬菌体DNA的限制酶切消化139

1．蔗糖密度梯度离心140

（二）λ噬菌体臂的纯化140

2．氯化钠梯度离心142

（三）用碱性磷酸酶处理的载体的制备143

（四）λ噬菌体载体的双酶切消化144

（五）λ噬菌体臂与外源DNA片段的连接145

二、λ噬菌体DNA的体外包装146

（一）λ噬菌体溶源状态的保持和检查147

（二）包装提取物的制备和λ噬菌体DNA的体外包装147

1．方法Ⅰ：用两个溶源菌制备包装提取物149

2．方法Ⅰ：用两种提取物进行体外包装151

3．方法Ⅱ：用一个溶源菌制备包装提取物152

4．方法Ⅱ：用一种提取物进行体外包装153

第五节 重组体的鉴定与分析154

一、λ噬菌体噬斑原位杂交154

（一）λ噬菌体噬斑在硝酸纤维素滤膜或尼龙膜上的固定154

（二）λ噬随体噬斑的原位扩增及其在硝酸纤维素滤膜上的固定156

（三）固定于硝酸纤维素滤膜的λ噬菌体噬斑的杂交157

二、λ噬菌体分离物的快速分析160

（一）平板裂解物法160

（二）液体培养法161

参考文献163

第三章粘粒载体167

第一节 粘粒载体中的克隆169

第二节 粘粒载体170

一、用于在细菌中增殖真核DNA的粘粒载体172

1．pJB8172

2．c2RB173

3．poos1EMBL175

二、用于转染哺乳动物细胞的粘粒载体176

1．pHC79-2cos/tk176

2．pCV103、pCV107、pCV108176

5．cos202、cos203177

4．pHSG274177

3．pTM、pMC、pNNl177

6．pWE15、pWE16178

7．卡隆粒9载体系列179

第三节 应用粘粒载体构建基因组DNA文库181

一、在磷酸酶处理过的粘粒载体中克隆181

（一）载体DNA的制备181

1．连接预试验183

（二）用MboI或Sau3AI对真核DNA进行部分消化184

（三）连接和包装184

二、在经两种限制酶消化并经磷酸酶处理的粘粒载体中克隆185

（一）载体DNA的制备186

（二）用碱性磷酸酶处理真核DNA187

（三）连接和包装189

三、含有双cos位点的载体的制备190

第四节 粘粒文库的扩增和贮存191

（一）影印滤膜192

（二）粘粒文库在液体培养中的扩增194

（三）已包装粘粒的转导性裂解物的制备195

第五节 应用粘粒时的常见问题196

参考文献198

第四章单链丝状噬菌体载体201

第一节 丝状噬菌体的生物学202

第二节 丝状噬菌体载体203

一、M13噬菌体载体205

二、M13噬菌体载体的宿主菌207

三、丝状噬菌体载体克隆中经常遇到的问题212

四、噬菌粒：带有丝状噬菌体复制起点的质粒212

（一）铺平板细菌的制备215

一、M13噬菌体的噬斑纯化215

（二）用M13噬菌体铺平板215

五、重组丝状噬菌体与噬菌粒所产生的单链DNA的用途215

第三节 M13噬菌体的繁殖及其DNA的制备215

（三）挑取M13噬斑217

二、利用单个M13噬斑制备噬菌体原种217

（一）液体培养217

三、M13噬菌体DNA的制备218

（一）M13噬菌体复制型DNA的小规模制备218

（二）M13噬菌体单链DNA的小规模制备220

（四）M13噬菌体单链DNA的大规模制备221

（三）M13噬菌体复制型双链DNA的大规模制备221

第四节 M13噬菌体克隆及感受态细菌的转染222

（一）外源DNA在M13噬菌体载体的克隆223

（二）感受态细菌的制备224

（三）用M13噬菌体转染感受态细菌224

第五节 重组体的鉴定与分析225

（一）直接电冰225

（三）小规模制备的M13噬菌体复制型DNA的分析226

（二）M13噬菌体的噬斑原位杂交226

（四）重组M13噬菌体中外源DNA插入方向的鉴定227

第六节 噬菌粒克隆228

（一）M13KO7的培养230

（二）单链噬菌粒DNA的制备230

（三）利用超感染法筛选菌落231

参考文献233

第五章分子克隆中所用的酶237

第一节 限制酶和DNA甲基化酶237

一、限制酶产生的末端的连接237

（一）匹配粘端237

（二）平端243

（三）不匹配的粘端244

二、同裂酶246

3．大肠杆菌中依赖于甲基化酶的系统247

2．dcnt甲基化酶247

1．dum甲基化酶247

三、DNA的甲基化作用247

（一）大肠杆菌常用菌株的甲基化作用247

4．大肠杆菌M. EcoRI甲基化酶255

（二）通过DNA甲基化作用对限制酶切位点进行修饰255

（三）甲基化对DNA限制酶切图的影响257

四、利用限制酶对DNA进行消化259

（一）限制酶消化反应的进行259

第二节 分子克隆中常用的其他酶262

一、DNA聚合酶262

（一）大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ（全酶）264

1．用途264

2．反应例解265

（二）大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ大片段（Klenow片段）267

1．用途267

2．反应例解268

1．用途270

（三）T4噬菌体DNA聚合酶270

2．反应例解271

（四）T7噬菌体DNA聚合酶273

1．用途273

（五）经修饰的T7噬菌体DNA聚合酶（测序酶）274

（六）Taq DNA聚合酶及AmpliTaqTM DNA聚合酶274

1．用途274

2．反应例解275

（七）反转录酶（依赖于RNA的DNA聚合酶）275

1．用途276

2．反应例解277

（八）末端转移酶（末端脱氧核苷酸转移酶）278

1．用途278

1．用途279

（一）SP6噬菌体及T7和T3噬菌体RNA聚合酶279

二、依赖于DNA的RNA聚合酶279

2．反应例解279

2．反应例解280

三、连接酶、激酶及磷酸酶280

（一）T4噬菌体DNA连接酶282

1．用途282

2．反应例解282

（二）大肠杆菌DNA连接酶283

1．反应例解283

（三）T4噬菌体RNA连接酶284

1．用途284

2．反应例解284

（四）T4噬菌体多核苷酸激酶284

1．用途285

2．反应例解285

1．用途286

（五）碱性磷酸酶286

2．反应例解287

四、核酸酶287

（一）BAL 31核酸酶287

1．用途287

2．反应例解289

（二）S1核酸酶291

1．用途291

2．反应例解291

（三）绿豆核酸酶291

1．用途292

（四）核糖核酸酶A292

1．用途292

（五）核糖核酸酶T1292

（六）脱氧核糖核酸酶Ⅰ293

1．用途293

1．用途293

1．用途294

2．反应例解294

（八）λ噬菌体外切核酸酶295

1．用途295

2．反应例解295

第三节 DNA结合蛋白296

（一）单链DNA结合蛋白（SSB）296

1．用途296

（二）RecA蛋白296

1．用途296

（三）拓扑异构酶Ⅰ297

参考文献298

一、概述304

第一节 琼脂糖凝胶电泳304

第六章DNA的凝胶电泳304

（一）影响琼脂糖凝胶DNA迁移速率的因素305

1．DNA的分子大小305

2．琼脂糖浓度306

3．DNA的构象306

4．所加电压306

5．电场方向307

6．碱基组成与温度307

7．嵌入染料的存在307

8．电泳缓冲液的组成307

（二）琼脂糖凝胶电泳装置308

二、琼脂糖凝胶的制备和检查309

（一）琼脂糖凝胶的制备309

（二）微型凝胶313

（四）溴化乙锭溶液的净化处理314

1．溴化乙锭浓溶液（即浓度＞0.5mg/ml的溴化乙锭溶液）的净化处理314

（三）琼脂糖凝胶中DNA的染色314

2．溴化乙锭稀溶液（如含有0.5μg/ml 溴化乙锭的电泳缓冲液）的净化处理315

（五）摄影315

（六）碱性琼脂糖凝胶电泳316

三、琼脂糖电泳分离的DNA的回收及纯化318

（一）DEAE-纤维素膜的电泳回收法319

（二）透析袋电洗脱法321

（三）从低熔点琼脂糖凝胶中回收DNA322

（四）纯化从琼脂糖凝胶中回收的DNA323

1．DEAE-Sephacel柱层析法323

2．有机溶剂抽提法324

第二节 聚丙烯酰胺凝胶电泳325

一、非变性聚丙烯酰胺凝胶的制备327

二、聚丙烯酰胺凝胶中DNA的检测330

（一）溴化乙锭染色330

2．固定的干凝胶331

1．未固定的湿凝胶331

（二）放射自显影331

三、从聚丙烯酰胺凝胶中分离DNA片段332

（一）“压碎与浸泡”法332

第三节 其他类型的凝胶333

一、链分离凝胶333

二、变性梯度聚丙烯酰胺凝胶333

三、脉冲电场凝胶电泳334

（一）装置的设计334

（二）脉冲电场凝胶电泳所分离DNA的染色335

（三）用于脉冲电场凝胶电泳的DNA的制备336

1．从哺乳动物细胞中分离完整的DNA336

2．从酵母中分离完整的DNA337

3．琼脂糖凝胶块中的DNA的限制酶消化338

（四）脉冲电场凝胶电泳的标准参照物338

参考文献340

（一）实验程序343

一、控制RNA酶的活性343

第七章真核细胞mRNA的提取、纯化及分析343

第一节 RNA的提取和纯化343

（二）RNA酶的抑制剂344

（三）破碎细胞和灭活RNA酶同步进行的方法345

二、RNA的分离345

（一）哺乳动物细胞总RNA的分离345

（二）哺乳动物细胞总RNA的快速分离348

（三）哺乳动物细胞胞质RNA的分离349

（四）卵和胚胎细胞总RNA的分离351

（五）用强烈变性剂提取总RNA352

1．通过硫氰酸胍提取和氯化铯离心制备RNA352

2．用盐酸胍和有机溶剂提取RNA355

三、带poly (A)的RNA 的分离356

四、在氢氧化甲基汞存在下进行RNA分级分离359

（一）在含有氢氧化甲基汞的琼脂糖凝胶上进行RNA电泳359

1．从含有氢氧化甲基汞的琼脂糖凝胶中回收RNA360

（二）通过氢氧化甲基汞-蔗糖梯度离心对RNA进行分级分离361

第二节 RNA的分析362

一、N orthen杂交363

（一）经乙二醛和二甲基亚砜变性处理后进行的RNA电泳364

（二）在含有甲醛的凝胶上进行的RNA电泳366

（三）将变性RNA转移至硝酸纤维素滤膜367

（四）变性RNA转移至尼龙膜369

（五）在转移至硝酸纤维素滤膜前后进行的RNA染色370

1．方法Ⅰ370

2．方法Ⅱ371

（六）杂交和放射自显影371

二、RNA的斑点和狭线杂交372

（一）RNA的狭线杂交372

（二）细胞质RNA的狭线杂交373

三、RNA的S1核酸酶作图374

（一）用S1核酸酶和双链DNA探针进行RNA作图377

（二）用S1核酸酶和单链DNA探针进行RNA作图380

四、用核糖核酸酶和放射性标记的RNA探针进行RNA作图383

五、用引物延伸法进行RNA的分析388

参考文献392

第八章cDNA文库的构建和分析396

第一节 cDNA克隆的策略396

一、制备用于cDNA克隆的mRNA396

（一）mRNA的来源396

（二）mRNA的完整性397

（三）高丰度RNA398

（四）低丰度mRNA399

（五）富集方法399

1．按大小对mRNA进行分级分离400

2．CDNA的分级分离400

二、cDNA第一链的合成401

3．多聚核糖体的免疫学纯化法401

三、cDNA第二链的合成403

（一）自身引导法403

（二）cDNA第二链的置换合成法404

（三）cDNA第二链的引导合成405

四、双链cDNA的分子克隆408

（一）同聚物加尾408

（二）合成的DNA接头和衔接头411

（三）克隆cDNA的其他方法414

1．mRNA-cDNA克隆414

2．依次连加不同接头414

3．在Okayama-Berg 载体中克隆cDNA414

4．利用引物一衔接头克隆cDNA416

5．在单链载体中克隆cDNA417

五、用于cDNA克隆的λ噬菌体载体418

1．λgt10419

（一）λ噬菌体载体λgt 10和λgt11419

2．λgt11420

（二）其他用于cDNA克隆的λ噬菌体载体422

1．λORF8422

2．λgt18、λgt19424

3．λgt20、λgt21425

4．λgt22、λgt23425

5．λZAP427

六、目的cDNA克隆的鉴定428

（一）筛选方法428

1．核？杂文428

2．特异性抗原的免疫学检测430

3．cDNA克隆的同胞选择431

（二）确证cDNA克隆的方法431

第二节 cDNA克隆的操作流程432

（一）注意事项433

一、在λ噬菌体中构建cDNA文库433

（二）cDNA第一链的合成程序437

（三）cDNA第二链的合成程序440

（四）cDNA的甲基化441

（五）与合成的磷酸化接头相连接442

（六）cDNA的大小选择444

（七）与λ噬菌体臂连接445

（八）cDNA插入片段的分析447

（九）完整cDNA文库的生成448

（十）cDNA文库的扩增448

1．扩增构建于λgt10噬菌体文库：筛除亲本噬菌体448

2．扩增构建于λgt11噬菌体及其衍生载体和λZAP或λZAPⅡ中的文库448

二、克隆cDNA时常见的问题449

参考文献451

第九章真核基因组DNA的分析和克隆456

（一）λ噬菌体和粘粒载体457

第一节 用于构建真核基因组DNA文库的载体457

一、引言457

（二）酵母人工染色体系统458

二、可用于构建真核基因组DNA文库的λ噬菌体载体459

三、用于构建真核基因组DNA文库的粘粒载体463

第二节 从哺乳动物细胞中分离高分子量DNA463

（一）从哺乳动物细胞中分离DNA：方案一464

（二）从哺乳动物细胞中分离DNA：方案二467

（三）从哺乳动物细胞中分离DNA：方案三468

第三节 高分子量真核DNA的限制酶部分消化469

（一）预试验469

（二）DNA部分消化物的大规模制备471

（三）基因组DNA片段3′凹端的不完全补平472

（四）基因组DNA文库的扩增473

一、琼脂糖凝胶电泳分离哺乳动物基因组DNA的限制酶切片段474

第四节 基因组DNA的Southern杂交分析474

二、将DNA从琼脂糖凝胶转移到固相支持体上475

（一）将DNA转移至硝酸纤维素滤膜478

1．DNA向硝酸纤维素滤膜的毛细管转移478

2．DNA从一块凝胶同时向两张硝酸纤维素滤膜转移479

（二）DNA从凝胶转移至尼龙膜480

1．DNA在中性条件下向尼龙膜的毛细管转移481

2．DNA在碱性条件下向尼龙膜的毛细管转移481

三、放射性标记的探针与固定化的核酸杂交483

（一）放射性标记的探针与固定于硝酸纤维素滤膜或尼龙膜上的核酸进行杂交486

（二）放射性标记的寡核苷酸与基因组DNA进行杂交489

（三）从硝酸纤维素滤膜和尼龙膜上除去放射性标记的探针490

1．从硝酸纤维素滤膜上除去探针490

2．从尼龙膜上除去探针490

参考文献491

第十章放射性标记DNA探针与RNA探针的制备495

第一节 均一标记的DNA探针的合成498

一、DNA的切口平移498

（一）切口平移贮存液498

（二）切口平移的操作步骤499

（三）另一种切口平移方法的操作步骤501

二、用随机寡核苷酸引物合成均一标记的DNA探针502

（一）利用变性的双链DNA合成探针503

1．利用引物延伸法合成放射性标记探针503

2．在熔化琼脂糖存在下进行DNA的放射性标记504

第二节 单链探针的制备505

一、用M13噬菌体载体合成单链DNA探针506

（一）引物：模板的比例与核苷酸的浓度506

（二）单链DNA探针的合成507

（三）Sepharose CL-4B碱性柱层析分离小（＜150核苷酸）探针509

（四）疑难解答509

二、用噬菌体依赖于DNA的RNA聚合酶以及双链DNA为模板体外转录合成RNA探针510

（一）可供制备RNA探针的质粒载体511

（二）DNA模板的制备512

（三）RNA体外合成512

（四）高比活度放射性RNA探针的合成513

（五）疑难解答515

三、 cDNA探针的合成516

（一）cDNA克隆的鉴定516

1．差示筛选516

2．吸收探针517

3．扣除文库519

4．高比活度标记的扣除探针519

（二）以寡核苷酸作探针合成与单链RNA互补的总cDNA探针520

（三）用oligo（dT）作引物合成放射性标记的扣除cDNA探针522

（四）高比活度扣除探针的合成523

一、用大肠杆菌DNA聚合酶I的K lenow片段标记双链DNA的3′端525

第三节 DNA的5′或3′末端标记525

二、用T4噬菌体DNA聚合酶标记双链DNA的3′端527

（一）DNA的快速末端标记527

（二）置换合成529

三、用T4噬菌体多核苷酸激酶标记DNA的5′端530

（一）正向反应530

1．以带5′突出端的DNA分子作底物530

2．以带平端成5′凹端的DNA分子作底物532

3．DNA的去磷酸化532

（二）交换反应533

1．以带5′磷酸突出端的DNA分子作模板533

参考文献535

第十一章合成寡核苷酸探针538

第一节 寡核苷酸探针的类型和应用538

一、特定序列的单一寡核苷酸538

二、较短而简并性较高的成套寡核苷酸539

（一）寡核苷酸长度和简并性对杂交特异性的影响540

（二）较短而简并性较高的成套寡核苷酸的设计542

三、较长而简并性较低的成套寡核苷酸543

（一）猜测体543

1．猜测体的设计545

2．猜测体的标记546

（二）在具有简并性的位置上带有一个中性碱基的寡核苷酸546

第二节 合成寡核苷酸的纯化和放射性标记549

一、合成寡核苷酸的纯化549

（一）合成寡核苷酸的精制550

（二）变性聚丙烯酰胺凝胶电泳法回收寡核苷酸551

（三）硅胶反相层析法分离寡核苷酸555

二、通过T4噬菌体多核苷酸激酶催化的磷酸化反应标记合成的寡核苷酸556

（二）乙醇沉淀法纯化放射性标记的寡核苷酸558

（三）CPB沉淀法纯化放射性标记的寡核苷酸558

（一）概述558

三、放射性标记的合成寡核苷酸的纯化558

（四）Bio-Gel P-60层析法纯化放射性标记的寡核苷酸560

（五）Sep-Pak C18柱层析法纯化放射性标记的寡核苷酸561

四、用大肠杆菌DNA聚合酶Iklenow片段标记合成的寡核苷酸562

第三节 寡核苷酸探针的杂交条件565

一、引言565

二、寡核苷酸与靶序列的完全配对杂交体解链温度的计算565

三、对碱基错配所发生影响的估计566

四、成套寡核苷酶的杂交566

（一）概述566

（二）含有烷基季铵盐的溶剂的配制和使用567

五、猜测体杂交568

六、在简并位置上带有中性碱基的寡核苷酸的杂交569

七、根据实验确定解链温度569

参考文献572

第十二章利用抗体和寡核苷酸筛选表达文库576

第一节 利用质粒和λ噬菌体载体构建表达文库577

（一）质粒和λ噬菌体表达载体的相对优越性577

（二）基因组DNA和cDNA表达文库578

（三）构建于质粒的表达文库579

（四）构建于λ噬菌体的表达文库580

第二节 抗体在免疫学筛选中的应用581

（一）抗体的选择581

（二）抗血清的纯化582

（三）大肠杆菌表达蛋白所结合的抗体的检测方法582

（四）免疫学筛选结果的确证583

第三节 表达文库的免疫学筛选583

一、筛选构建于λ噬菌体载体的表达文库583

二、菌落筛选587

（一）制备用于筛选的菌落587

1．方法Ⅰ587

2．方法Ⅱ588

（二）菌落免疫学筛选中滤膜的处理589

三、假筛选法去除抗大肠杆菌抗体590

四、制备大肠杆菌裂解液用于吸收抗大肠杆菌抗体590

五、亲和层析法去除抗大肠杆菌抗体590

六、免疫球蛋白G的放射性碘化591

第四节 利用合成寡核苷酸筛选构建于λ噬菌体的cDNA文库592

（一）放射性标记多联体探针的制备593

（二）通过放射性标记多联体探针进行筛选时滤膜的制备594

（三）用放射性标记DNA探测固定化蛋白质595

（四）制备含有由λgt11噬菌体溶源菌所编码的融合蛋白的裂解液595

参考文献598

第十三章DNA序列测定602

第一节 序列测定的技术和策略602

一、Sanger 双脱氧链终止法602

2．模板603

3．DNA聚合酶603

1．引物603

（一）Sanger法DNA测序的试剂603

4．放射性标记的dNTP607

5．dNTP类似物607

二、Maxam-Gilbert DNA化学降解法608

三、测序策略610

（一）确证性测序610

（二）从头测序610

1．选择随机或定向测序策略的影响因素611

第二节 随机测序615

一、建立随机重叠克隆的文库616

（一）靶 DNA的纯化和连接616

（二）靶DAN的断裂618

1．超声处理618

2．在锰离子存在下进行的DNA酶I消化619

（四）载体DNA的制备620

（三）DNA的修补及大小选择620

（五）与载体DNA连接621

第三节 定向测序622

一、生成若干套嵌套的缺失突变体622

（一）利用外切核酸酶Ⅲ生成嵌套的缺失突变体626

第四节 Sanger双脱氧链终止法测序629

一、设立双脱氧测序反应629

（一）单链DNA的制备629

（二）引物的制备629

（三）微量滴定板629

（四）链延伸一链终止反应混合液630

1．DNTP和ddNTP贮存液630

二、变性聚丙烯酰胺凝胶631

（一）配制缓冲液梯度的聚丙烯酰胺凝胶632

（二）梯度测序凝胶的加样和电泳637

（三）测序凝胶的放射自显影639

（四）从凝胶上读取DNA序列640

三、应用大肠杆菌DNA聚合酶|Klenow片段的双脱氧测序反应641

（一）准备工作641

1．dNTP使用液的配制641

2．ddNTP使用液的配制641

（二）测序反应642

四、应用测序酶的双脱氧测序反应644

（一）准备工作645

（二）测序反应645

五、测定变性双链DNA模板的序列647

（一）测定经CsCl-溴化乙锭梯度平衡离心纯化的质粒DNA的序列648

（二）通过氯化锂沉淀从小量制备的质粒DNA中除去RNA649

六、双脱氧测序中出现的问题649

（一）模板特异的问题649

（三）聚丙烯酰胺凝胶出现的问题650

（二）全局性问题650

第五节 Maxam-Gilbert法测序653

一、概论653

（一）靶DNA的不对称标记653

（二）制备靶DNA以供Maxam-Gilbert法测序657

（三）试剂、溶液和装置657

二、传统Maxam-Gilbert测序法660

（一）在G残基上的裂解660

（二）在嘌呤（A+G）残基上的裂解661

（三）在嘧啶残基上的裂解（C+T）661

（四）在C残基上的裂解661

（五）在A和C残基上的裂解（A＞C）662

（六）用哌啶处理样品662

四、Maxam-Gilbert测序法疑难问题解答663

（一）阅读测序凝胶663

三、另一种Maxam-Gilbert测序法663

（二）常见问题665

第十四章聚合酶链式反应体外扩增DNA672

一、PCR扩增技术的应用674

（一）生成克隆化双链DNA中的特定序列作为探针674

（二）选择性扩增特定DNA区段以生成非克隆化基因的特异性探针675

（三）从少量mRNA生成cDNA文库676

（四）生成大量DNA以进行序列测定676

（五）突变的分析677

（六）染色体缓移677

二、扩增的方法679

（一）注意事项679

（二）PCR反应系统的组成680

1．寡核苷酸680

2．用于PCR的缓冲液680

（三）扩增反应681

5．靶序列681

4．脱氧核苷三磷酸681

3．TaqDNA聚合酶681

（四）扩增由mRNA反转录而成的cDNA683

三、Sanger双脱氧链终止法测定DNA扩增产物的序列684

（一）方案一：利用放射性标记的寡核苷酸引物测定DNA扩增产物的序列684

1．通过离心透析去除DNA扩增产物中的寡核苷酸及过多的dNTP684

2．寡核苷酸测序引物的放射性标记685

3．退火686

（二）方案二：测定由不对称扩增反应所生成单链DNA模板的序列687

四、靶序列初始浓度的定量分析688

参考文献691

第十五章克隆化DNA的定点诱变693

第一节 缺失与插入的形成693

一、简单的缺失或插入693

二、系统缺失和插入694

（一）插入接头的诱变694

1．利用切点频繁出现的限制酶产生插入接头的突变体696

参考文献699

（二）若干套嵌套的缺失突变体的产生700

1．利用BAL 31核酸酶消化法产生若干套双向的缺失突变体705

2．在Mn2+存在下用胰DNA酶I切割双链闭环DNA709

（三）接头分区诱变712

1．带BglⅡ接头及kanr基因的靶片段的分离716

2．靶 DNA片段的回收721

3．靶DNA的切出722

4．分析在靶区域中含有BglⅡ接头的克隆723

第二节 寡核苷酸介导的诱变724

一、概述724

（一）单链模板DNA的制备725

（二）诱变寡核苷酸的设计和挑选726

（三）寡核苷酸与模板DNA的杂交和引物延伸727

（五）突变DNA片段的回收729

（四）大肠杆菌的转染及突变体的筛选729

（六）提高诱变效率的若干方法730

二、双引物诱变法731

三、利用标记寡核苷酸对噬斑和菌落进行杂交筛选733

（一）通过磷酸化反应对寡核苷酸进行放射性标记733

（二）利用放射性标记的寡核苷酸对M13噬菌体噬斑进行杂交筛选734

（三）利用放射性标记的寡核苷酸对细菌菌落进行杂交筛选736

四、通过筛除带尿嘧啶的模板链进行诱变（Kunkel法）737

（一）带尿嘧啶的单链DNA的制备738

五、疑难解答741

第三节 通过诱变研究蛋白质741

一、在蛋白质编码区插入六聚体接头743

（一）六聚体接头的设计744

（二）六聚体接头的插入745

二、在特定的DNA区段上产生许多突变749

（一）成套的简并的诱变寡核苷酸的应用750

（二）用化学诱变剂处理双链DNA757

（三）用亚硫酸氢钠处理单链DNA758

（四）用损伤所有4种碱基的化学药品处理单链DNA758

（五）DNA聚合酶催化的核苷酸错掺758

参考文献760

第十六章克隆化基因在哺乳动物培养细胞中的表达765

第一节 蛋白质的表达765

一、从克隆化基因表达蛋白质765

二、哺乳动物细胞表达载体的功能元件766

（一）便于在细菌中构建、增殖与扩增重组载体的原核质粒序列767

（二）由表达外源DNA序列所必需的所有元件组成的真核表达组件767

1．启动子和增强子元件767

2．终止信号和加poly（A）信号768

3．剪接信号768

4．用于复制和选择的元件769

（三）外源DNA序列775

三、载体系统776

（一）不带真核复制子的质粒型载体776

（二）带真核病素调控序列元件的质粒表达载体776

1．SV40载体776

2．牛乳头瘤病毒载体781

3．Epstein-Barr病毒载体783

（三）扩增系统785

第二节 重组载体导入哺乳动物细胞786

一、磷酸钙和DNA共沉淀物的传染787

（一）磷酸钙介导的贴壁细胞的通用转染方法788

（二）磷酸钙介导的贴壁细胞悬浮转染法791

（三）磷酸钙介导的悬浮培养细胞转染法791

（四）改进的磷酸钙介导细胞转染法792

二、DEAE—葡聚糖介导的转染793

（一）利用DEAE—葡聚糖的转染：方法一794

（二）利用DEAE—葡聚糖的转染：方法二795

三、利用Polybrene的DNA转染797

四、利用原生质体融合的DNA转染798

（一）原生质体制备798

（二）原生质体与哺乳动物贴壁细胞的融合799

（三）原生质体与悬浮生长的哺乳动物细胞的融合800

五、电穿孔法DNA转染801

第三节 研究基因调控的策略802

一、带报道基因的载体803

二、氯霉素乙酰转移酶和β—半乳糖苷酶活性的测定804

（一）提取物的制备804

（二）氯霉素乙酰转移酶的测定805

1．方法Ⅰ：薄层层析法805

2．方法Ⅱ：有机溶剂抽提法806

3．方法Ⅲ：反应产物的闪烁液扩散法807

（三）哺乳动物细胞提取物中β—半乳糖苷酶的测定808

第四节 哺乳动物细胞中的表达克隆809

（一）通过cDNA的表达进行克隆809

（二）基因组DNA的表达克隆810

参考文献813

第十七章克隆化基因在大肠杆菌中的表达822

第一节 融合蛋白的产生822

（一）表达IacZ融合基因的载体系统823

（二）表达质粒的构建和融合蛋白的检测825

（三）制备融合蛋白用于诱导抗体产生826

第二节 完整天然蛋白的产生827

一、原核基因的表达：启动子827

（一）λ噬菌体PL启动子827

（二）trp-lac启动子828

（三）T7噬菌体启动子829

二、真核基因的表达：启动子和核糖体结合位点831

（一）制备DNA片段以插入功能性核糖体结合位点的附近832

1．编码蛋白质氨基酸的DNA的合成832

2．引物修补832

3．限制酶切位点的改造833

（二）利用所制备的片段进行基因表达838

三、其他表达系统839

（一）可用蛋白酶或溴化氰裂解的融合蛋白的表达840

1．合成可被因子Xa切割的杂合蛋白841

（二）外源蛋白的分泌型表达841

1．由phoA介导的表达与分泌842

四、克隆化基因表达水平的定量843

（一）利用β—半乳糖苷酸活性进行表达检测844

五、克隆化基因表达水平的提高844

六、蛋白质纯化845

（一）包涵体845

2．包涵体的洗涤与纯化846

1．细胞的裂解846

（二）包涵体的溶解847

参考文献849

第十八章克隆化基因所表达蛋白质的检测与分析852

第一节 抗体的产生852

（一）免疫应答的影响因素853

1．动物种类853

2．遗传因素853

3．抗原的物理状态853

4．抗原的用量854

5．注射途径854

6．免疫程序854

（二）使用小量抗原进行免疫的方法855

（三）单克隆抗体855

1．合成肽与匙孔？血蓝蛋白的偶联856

（四）抗合成肽抗血清的制备856

（五）抗血清的收集与保存857

第二节 抗体的纯化858

一、A蛋白吸附法纯化抗体858

二、吸附法纯化抗体859

（一）从抗血清中去除交叉反应性抗体860

（二）特异性抗体的纯化860

1．利用固定于硝酸纤维素滤膜上的抗原亲和纯化单特异性抗体861

第三节 免疫学测定862

一、固相放射免疫测定862

（一）用两种抗体作固相放射免疫分析863

（二）抗体的碘化865

1．用氯胺T法对抗体进行放射性碘化866

二、免疫沉淀法867

（一）靶蛋白的放射性标记867

1．用[35S]甲硫氨酸和[35S]半胱氨酸标记哺乳动物细胞868

2．通过体内代谢途径对酵母和细菌表达的蛋白质进行放射性标记869

（二）细胞的裂解870

1．哺乳动物培养细胞的裂解873

2．酵母的机械破碎法873

3．酵母的酶裂解法874

4．快速裂解酵母细胞875

5．细菌的裂解876

（三）抗原-抗体复合物的形成877

1．细胞裂解液的预清除878

（四）靶蛋白的免疫沉淀879

（五）蛋白质的聚丙烯酰胺凝胶电泳880

1．SDS聚丙烯酰胺凝胶的配制881

2．SDS聚丙烯酰胺凝胶的？制882

3．用考马斯亮蓝对SDS聚丙烯酰胺凝胶进行染色885

4．用银盐对SDS聚丙烯酰胺凝胶进行染色886

5．SDS聚丙烯酰胺凝胶的干燥887

三、蛋白质从SDS聚丙烯酰胺凝胶转移至固相支持体：固定化蛋白质的免疫学测定（Western印迹法）888

（一）样品的制备和电泳889

1．用凝胶加样缓冲液裂解哺乳动物细胞和组织889

（二）蛋白质从SDS聚丙烯酰胺凝胶转移至固相支持体891

（三）对固定于硝酸纤维素滤膜上的蛋白质进行染色893

1．丽春红S染色893

2．用印度墨汁染色894

（四）封闭硝酸纤维素滤膜的免疫球蛋白结合位点894

（五）第一抗体和靶蛋白的结合895

1．用抗靶蛋白的第一抗体与硝酸纤维素滤膜共温育的方法895

2．用二级免疫试剂与硝酸纤维素滤膜温育的方法895

3．酶联抗体生色底物的使用897

第四节 mRNA的翻译898

一、RNA在网织红细胞裂解液中的翻译898

（一）兔网织红细胞裂解液的制备898

（二）网织红细胞裂解液的翻译900

二、合成mRNA的体外翻译901

（一）合成mRNA的制备902

（二）合成RNA的翻译904

参考文献905

附录A细菌培养基、抗生素和菌株908

一、液体培养基908

（一）LB培养基（Luria-Bertani培养基）908

（二）NZCYM培养基908

（三）NZYM培养基908

（四）NZM培养基908

（五）高浓度肉汤909

（六）SOB培养基909

（七）SOC培养基909

（八）2×YT培养基909

（九）M9培养基910

二、含有琼脂或琼脂糖的培养基910

1．在液体培养基中生长的细菌培养物911

2．在琼脂平板上生长的细菌培养物911

（一）穿刺培养物911

（二）含甘油的培养物911

三、保存培养基911

四、抗生素912

五、用于λ噬菌体操作的溶液912

（一）麦芽糖912

（二）SM912

（三）TM913

（四）λ噬菌体稀释液913

六、细菌菌株一览表913

附录B分子克隆中使用的试剂与缓冲液的配制919

一、酸和碱的浓度919

（一）常用缓冲液的pKa值919

（二）各种pH值的Tris缓冲液的配制919

（四）各种浓度的酸碱贮存液的近似pH值920

（三）常见的市售酸碱的浓度920

（一）酚921

1．酚的平衡921

（二）酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）921

二、有机试剂的配制921

三、原子量922

1．同位素资料924

四、贮存液924

五、酶类929

（一）溶菌酶929

（二）蛋白水解酶930

（三）无DNA酶的RNA酶930

（四）无RNA酶的DNA酶930

1．在琼酶糖-5′-（4-氨基苯磷酰）尿苷-2′（3′）-磷酸上进行亲和层析930

2．Macaloid吸附法931

六、常用缓冲液932

3．在碘乙酸盐存在下加热处理932

（一）磷酸缓冲液933

（二）用于小量制备质粒DNA的碱裂解缓冲液934

（三）电泳缓冲液934

（四）酶缓冲液936

附录C核酸的性质939

一、有关DNA的重要统计学资料939

（一）B型DNA939

（二）各种生物的单倍体DNA含量939

（三）DNA的长度与其分子量的关系941

（四）DNA在溶液中的摩尔浓度941

二、嘌呤和嘧淀942

（一）嘌呤环和嘧啶环的原子编号942

（二）腺嘌呤及其有关化合物943

（三）胞嘧啶及其有关化合物944

（四）鸟嘌呤及其有关化合物945

（五）胸腺嘧啶及其有关化合物946

（六）尿嘧啶及其有关化合物947

（七）稀有碱基948

（八）DNA测序中用作链终止剂的核苷类似物948

三、核苷酸序列资料库949

附录D密码子与氨基酸950

一、遗传密码950

二、在分子克隆中用于抑制无义突变的原核抑制基因950

三、氨基酸的特性951

（一）氨基酸的分类951

附录E分子克隆中的常用技术954

一、玻璃制品和塑料制品954

（一）玻璃制品、塑料制品及玻璃棉的硅烷化954

二、核酸的纯化954

（一）用酚：氯仿抽提955

1．Saran包装膜法956

（二）溴化乙锭荧光法测定双链DNA的含量956

三、DNA和RNA的定量956

（一）分光光度法测定DNA及RNA的含量956

2．琼脂糖平板法957

3．微型凝胶法957

四、溴化乙锭溶液的净化处理957

（一）溴化乙锭浓溶液（即浓度＞0.5mg/ml的溴化乙锭溶液）的净化处理957

1．方法Ⅰ957

2．方法Ⅱ958

（二）溴化乙锭稀溶液（如含有0.5μg/ml溴化乙锭的电泳缓冲液）的净化处理958

1．方法Ⅰ958

2．方法Ⅱ958

五、核酸的浓缩959

（一）用乙醇或异丙醇沉淀959

1．在微量离心管中沉淀DNA960

2．用乙醇沉淀RNA961

3．用氯化锂沉淀大分子RNA962

4．用丁醇抽提法浓缩核酸962

（二）32P标记核苷酸的乙醇—水混合液的干燥962

六、核酸中放射性的测定963

（一）核酸的三氯乙酸沉淀法963

（二）DE-81滤膜吸附法964

七、用于凝胶电泳的标准参照物964

八、放射自显影964

（一）荧光自显影967

（二）不同的放射自显影方法的灵敏度967

（三）放射自显影的操作968

九、利用羟基磷灰石层析分离单链与双链DNA970

十、凝胶过滤层析972

（一）Sephadex的水化973

（二）柱层析973

十一、离心柱层析974

十二、透析管的处理975

附录F亚克隆976

一、3′凹端的补平976

二、3′突出端的去除977

三、在质粒载体上进行快速克隆978

四、在平端DNA上加入接头979

（一）非磷酸化接头的酶促磷酸化980

（二）磷酸化接头与平端靶片段的连接980

附录G 生产厂商名录表983

附录部分参考文献988

索引992

译者增编附录一 注射针基本尺寸表1022

译者增编附录二 希腊字母表1024

译者增编附录三 专有名词详解1025

译者增编附录四 英汉基因工程词汇1039