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第一章 载体-宿主体系1

质粒1

在质粒中进行克隆9

噬菌体λ13

裂解循环13

溶源性16

λ噬菌体载体的构建17

选择合适的载体18

噬菌体λ载体图19

粘粒29

单链噬菌体41

噬菌体M13载体42

总结43

第二章 细菌菌株与病毒的繁殖和保存46

菌株的检验46

单菌落的分离46

细菌菌株的生长、保存和保藏48

噬菌体λ噬菌斑的纯化49

从单斑制备噬菌体λ原液50

培养基和抗生素52

液体培养基52

含琼脂或琼脂糖的培养基54

抗生素54

感染57

第三章 噬菌体λ和质粒DNA的分离57

噬菌体λ的大量制备57

诱导58

噬菌体λ的提纯59

噬菌体λDNA的提取62

质粒DNA的大量分离63

细菌的生长和质粒的扩增63

菌体的采集和裂解64

利用氯化铯-溴化乙锭梯度平衡离心提纯闭环DNA66

从质粒DNA制品中去除RNA67

限制酶69

同裂酶69

第四章 分子克隆中所用的酶69

甲基化作用70

用限制酶消解DNA74

分子克隆中使用的其它酶类75

大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ76

大肠杆菌DNA聚合酶ⅠKlenow片段79

T4DNA聚合酶82

用T4多核苷酸激酶标记DNA5′末端86

依赖于RNA的DNA聚合酶90

DNA的脱磷酸作用93

核酸酶Bal3195

核酸酶Sl97

核糖核酸酶类98

绿豆核酸酶98

脱氧核糖核酸酶Ⅰ99

核酸外切酶Ⅶ99

核酸外切酶Ⅲ99

λ核酸外切酶101

多聚（A）聚合酶101

T4DNA连接酶102

T4RNA连接酶102

EcoRI甲基化酶103

末端脱氧核苷酸转移酶103

琼脂糖凝胶电泳104

第五章 凝胶电泳104

凝胶电泳槽106

缓冲液106

琼脂糖凝胶的制备110

琼脂糖凝胶中DNA的染色111

摄影技术112

微型凝胶112

从琼脂糖凝胶中回收DNA113

碱性琼脂糖凝胶117

聚丙烯酰胺凝胶电泳118

聚丙烯酰胺凝胶的制备118

从聚丙烯酰胺凝胶中分离DNA片段121

分离链的凝胶121

利用聚丙烯酰胺凝胶分离链122

利用琼脂糖凝胶分离链123

利用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离短的双链DNA的链124

第六章 真核细胞mRNA的抽提、提纯和分析126

哺乳动物细胞mRNA的分离128

细胞总RNA的分离129

多聚（A）+RNA的选择131

RNA的凝胶电泳132

RNA的核酸酶Sl定位137

第七章 cDNA的合成和克隆140

cDNA的合成140

第一cDNA链的合成140

第二cDNA链的合成141

利用核酸酶Sl切割发夹环142

双链cDNA的分子克隆143

同聚物尾序143

合成的DNA接头144

克隆cDNA的其它方法145

cDNA克隆的策略148

高丰度mRNA148

低丰度mRNA148

cDNA克隆的程序151

双链cDNA的合成151

用核酸酶Sl消解156

双链cDNA的克隆157

将载体和双链cDNA进行退火159

通过依次加合接头来克隆双链cDNA160

利用质粒DNA转化大肠杆菌163

利用氯化钙程序转化163

第八章 将质粒和噬菌体λDNA引入大肠杆菌163

利用氯化钙／氯化铷程序转化164

大肠杆菌x1776的转化165

噬菌体λDNA的离体包装167

噬菌体λ溶源菌的保持和测定168

包装抽提物制备方案Ⅰ169

离体包装方案Ⅰ170

包装抽提物制备方案Ⅱ171

离体包装方案Ⅱ173

噬菌体λ载体中基因组文库的构建175

第九章 基因组文库的构建175

载体DNA的制备178

从组织培养生长的细胞中分离大分子量真核DNA181

真核DNA20kb片段的制备182

连接和包装184

文库的扩增188

粘粒载体基因组文库的构建189

磷酸酯酶处理的粘粒载体中的克隆190

用两种限制酶消解和磷酸酯酶处理过的粘粒载体中的克隆192

粘粒文库的扩增、贮存和筛选195

第十章 重组克隆的鉴定198

细菌菌落或噬菌斑的原位杂交198

筛选小量细菌菌落199

将菌落复印在硝酸纤维素滤膜上201

利用杂交筛选噬菌体λ噬菌斑202

噬菌体λ噬菌斑原位扩增后通过杂交进行筛选204

固定在滤膜上的DNA或RNA与放射性探针杂交205

与带有噬菌斑或菌落复印的硝酸纤维素滤膜杂交206

利用杂交选择来鉴定cDNA克隆208

利用与硝酸纤维素相结合的DNA进行杂交选择208

杂交选择的RNA在网织红细胞裂解液中转译215

注入到蛙卵母细胞的信使RNA的转译219

利用大肠杆菌中的重组，从噬菌体λ文库中筛选特异性DNA序列221

利用重组进行选择的原理221

在W3110r-m+(p3)（xVX）上进行噬菌体λ文库平板测定224

含有校正基因的噬菌体的遗传测定224

在πVX筛选中使用的菌株224

W3110r-m+（p3）的转化224

πVX的制备224

πVX系统的测定225

πVX系统的利用227

第十一章 重组体DNA克隆的分析228

质粒或噬菌体λDNA的快速分离228

快速分离小量质粒DNA228

快速分离小量噬菌体λDNA230

作限制酶切位点图232

一次和多次消解作图232

依次消解233

部分消解234

Southern转移236

DNA从琼脂糖凝胶转移到硝酸纤维素滤膜上237

Southern滤膜杂交239

小片段DNA次级克隆到质粒载体中241

利用粘性末端次级克隆DNA片段241

在次级克隆中利用合成的DNA接头241

连接两个平端末端DNA分子以创建限制性位点245

进行快速依次克隆的步骤246

第十二章 在大肠杆菌中表达克隆DNA的载体248

启动子248

利用噬菌体λPL启动子的载体249

其它启动子251

核糖体-结合位点251

真核基因的表达252

表达非融合的真核蛋白的载体252

表达融合的真核蛋白的载体257

克隆基因的最大表达265

增加基因剂量265

总结266

附录267

1：生化技术267

玻璃器皿和塑料器皿267

液体培养基268

有机试剂的配制268

用于噬菌体λ工作的溶液270

抗生素271

缓冲液和溶液的配制273

蛋白水解酶类274

酶类274

限制酶消解缓冲液276

常用电泳缓冲液276

常用凝胶载样缓冲液277

透析管的准备278

从乙醇和水混合液中干燥32P-标记的核苷酸278

核酸的纯化279

核酸的浓缩280

SephadexG-50层析282

DNA和RNA的定量284

放射自显影285

核酸中放射性的测量287

制备质粒多种聚合体作为分子量参照物288

用Maxam-Gilbert技术定序的方案288

2：pBR322291

pBR322的核苷酸序列291

pBR322的限制切点299

pBR322DNA的限制片段304

3：常用细菌菌株314

4：厂商地址和产品简介315

参考文献319