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目 录1

谈序1

第一章载体—宿主系统1

质粒1

施序2

译者的话3

前言4

用质粒进行的克隆8

λ噬菌体11

裂解性生长周期14

溶源性15

λ噬菌体载体的构建16

合适载体的选择17

λ噬菌体载体的图谱18

柯斯质粒36

单链噬菌体40

小结42

第二章 细菌菌株和病毒的增殖与保存44

菌株的鉴定44

单菌落的分离44

细菌菌株的生长、保持和保藏46

λ噬菌体噬斑的纯化46

从单噬斑制备λ噬菌体纯种47

液体培养基49

培养基和抗生素49

含琼脂或琼脂糖的培养基50

抗生素51

第三章λ噬菌体和质粒DNA的分离53

λ噬菌体的大量制备53

感染53

诱导（Pirrotta et al.,1971）54

λ噬菌体的纯化（Yamamoto et al.,1970）55

λ噬菌体DNA的抽提58

质粒DNA的大量分离58

细菌的生长和质粒的扩增59

细菌的收集和裂解59

用氯化铯—溴化乙锭等密度平衡离心和提纯闭环DNA61

质粒DNA制剂中RNA的去除62

第四章用于分子克隆的酶64

限制性内切酶64

同切口限制性内切酶64

甲基化作用67

用限制性核酸内切酶酶切DNA68

用于分子克隆的其他酶类69

大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ70

大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段73

T4 DNA聚合酶75

用T4多核苷酸激酶标记DNA5′末端78

依赖于RNA的DNA聚合酶82

DNA的去磷酸化84

核酸酶Bal3185

SI核酸酶88

绿豆核酸酶（绿豆种子）88

核糖核酸酶88

脱氧核糖核酸酶Ⅰ（DNase Ⅰ）89

核酸外切酶Ⅶ89

核酸外切酶Ⅲ90

λ核酸外切酶91

Poly（A）聚合酶91

T4 DNA连接酶92

T4 RNA连接酶92

脱氧核糖核苷末端转移酶（末端转移酶）93

EcoRI甲基化酶93

第五章 凝胶电泳95

琼脂糖凝胶电泳95

凝胶电泳槽96

缓冲液98

琼脂糖凝胶的制备98

琼脂糖凝胶中DNA的染色100

照相102

微型凝胶电泳102

琼脂糖凝胶中DNA的回收102

碱性琼脂糖凝胶105

聚丙烯酰胺凝胶电泳106

聚丙烯酰胺凝胶的制备107

聚丙烯酰胺凝胶中DNA片段的分离（Maxam and Gilbert 1977）109

链分离凝胶109

聚丙烯酰胺凝胶中的链分离110

琼脂糖凝胶中DNA的链分离111

用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳进行短双链DNA的链分离111

第六章真核细胞中mRNA的抽提、纯化与分析114

哺乳动物细胞中mRNA的分离115

细胞总RNA的分离117

Poly（A）+RNA的筛选118

RNA凝胶电泳119

RNA的核酸酶－S1酶切制图法123

cDNA第一链的合成125

cDNA的合成125

第七章 cDNA的合成与克隆125

cDNA第二链的合成127

发夹环的核酸酶S1切割127

双链cDNA的分子克隆127

同聚尾接法128

DNA接头的合成129

cDNA克隆的其他方法130

cDNA克隆的策略132

高丰度mRNAs132

低丰度mRNAs132

cDNA的克隆程序135

双链cDNA的合成135

用核酸酶S1的酶切138

双链cDNA的克隆140

载体和双链cDNA的退火142

双链cDNA克隆的顺序添加接头法142

第八章质粒和λ噬菌体DNA引入大肠杆菌145

质粒DNA在大肠杆菌中的转化145

用氯化钙转化的程序145

用氯化钙／氯化铷转化的程序146

大肠杆菌x1776的转化147

λ噬菌体DNA的体外包装148

λ噬菌体溶源菌的保存和检测149

包装提取物的制备方法Ⅰ150

体外包装方法Ⅰ151

包装抽提物的制备方法Ⅱ152

体外包装方法Ⅱ154

第九章 基因库的构建155

用λ噬菌体作载体构建基因库155

载体DNA的制备157

用组织培养细胞分离高分子量的真核DNA(Blim and Stafford 1976)160

真核DNA20kb片段的制备161

连接和包装163

基因库的扩增167

用柯斯载体构建基因库167

用经磷酸酶处理的柯斯载体进行的克隆168

用两种限制酶酶切和磷酸酶处理的柯斯载体进行的克隆170

柯斯质粒基因库的扩增、保存及筛选173

细菌菌落和噬菌体的原位杂交176

第十章重组克隆系的鉴定176

少量细菌菌落的筛选177

菌落在硝酸纤维素滤膜上的影印178

杂交筛选λ噬菌斑（Benton and Davis 1977）180

λ噬菌斑原位扩增后的杂交筛选181

固定于滤膜的DNA或RNA与放射性探针杂交182

印染在硝酸纤维素滤膜上的噬菌斑或菌落杂交183

用杂交筛选鉴定cDNA克隆株184

利用固定于硝酸纤维素滤膜上的DNA进行杂交选择185

杂交选择的RNA在网质红细胞裂解物中的翻译190

注入蛙卵母细胞内mRNA的翻译193

重组选择的原理195

通过大肠杆菌细胞内重组筛选λ噬菌体基因库中特定的DNA序列195

用于πVX质粒筛选的菌株197

πVX的制备198

W3110r-m+（P3）的转化198

将λ噬菌体基因库涂布于W3110r-m+（P3）（πVX）菌198

含有抑制基因噬菌体的遗传学检测法198

πVX系统的检测198

πVX系统的应用200

第十一章重组DNA克隆系的分析202

质粒DNA及λ噬菌体DNA的快速分离202

质粒DNA的少量快速分离202

λ噬菌体DNA的少量快速分离204

限制性核酸内切酶切点图谱的制作205

顺序式酶切206

用单酶切或多酶切作图206

部分酶切207

索氏吸印（Southern）转移209

DNA从琼脂糖凝胶向硝酸纤维素滤膜的转移209

索氏滤膜的杂交211

小片段DNA在质粒载体中的次级克隆212

具粘性末端的DNA片段的次级克隆213

在次级克隆中使用合成的DNA接头213

通过平头末端DNA片段连接产生限制酶切点216

克隆步骤的快速连续法217

启动子219

第十二章大肠杆菌中表达克隆化DNA的载体219

使用λ噬菌体PL启动子的载体220

其他启动子222

核糖体结合位点222

真核基因的表达223

表达非融合性真核蛋白的载体223

表达融合性真核蛋白的载体229

克隆化基因的高效表达235

增加基因的剂量235

小结235

玻璃和塑料器皿237

有机试剂的制备237

附录A生物化学技术237

液体培养基238

用于λ噬菌体操作的溶液239

抗生素239

缓冲液和溶液的配制240

蛋白水解酶242

酶243

限制性核酸内切酶酶切缓冲液244

常用的电泳缓冲液244

常用凝胶上样缓冲液244

32P标记核苷酸乙醇水混合液的干燥浓缩245

核酸的纯化245

透析袋的预处理245

核酸的浓缩246

Sephadex G-50层析248

DNA和RNA的定量249

放射自显影250

核酸放射活性的测定252

作分子量标记的多体质粒的制备252

Mavam-Gilbert序列测定技术253

附录B pBR322256

pBR322的核苷酸序列256

pBR322的限制酶切点260

pBR322DNA的限制性片段265

附录C常用细菌菌株274

参考文献276