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目录1

第1章 大肠杆菌、质粒和噬菌体1

1.1.1 极限培养基2

1.1 培养基及细菌学常用工具的准备2

1.1.3 固体培养基3

1.1.2 丰富培养基3

1.1.4 顶层琼脂培养基4

1.1.6 实验工具5

1.1.5 穿刺琼脂培养基5

1.2.3 基本方案3细菌培养的监测6

1.2.2 基本方案2大体积培养6

1.2 在液体培养基中培养6

1.2.1 基本方案1过夜培养6

1.3.2 基本方法2通过平板划线法分离单菌落7

1.3.1 基本方案1通过连续稀释法滴定和分离细菌菌落7

1.3 在固体培养基中培养7

1.3.5 辅助方案2菌株的保存和复苏8

1.3.4 辅助方案1影印平板8

1.3.3 基本方案3通过铺平板分离单个菌落8

1.4 经典细菌遗传学选论9

1.5 质粒图谱13

1.6.2 备择方案96孔微量滴定板碱裂解法17

1.6.1 基本方案1碱裂解小量制备法17

1.6 质粒DNA的小量制备17

1.6.3 基本方案2煮沸小量制备法18

基本方案1 碱裂解法19

1.7.1 粗制裂解物的制备19

1.6.4 辅助方案质粒DNA的保存19

1.7 质粒DNA的大量制备19

基本方案2 氯化铯／溴化乙锭平衡离心法20

1.7.2 备择方案利用离子交换层析和分子筛层析纯化质粒DNA21

1.8.1 基本方案1CaCl2转化法22

1.8 将质粒DNA导入细菌细胞22

1.8.3 基本方案2高效率的电转化方法23

1.8.2 备择方案一步法制备和转化感受态细菌23

1.9.1 丝状噬菌体载体的发展和应用25

1.9 源于丝状噬菌体的载体25

基本方案利用辅助噬菌体从质粒制备单链DNA27

1.1 0M13噬菌体衍生载体的制备和应用27

第2章 DNA的制备和分析29

2.1 水溶液中DNA的纯化和浓缩30

2.1.3 辅助方案1酚的平衡及酚／氯仿／异戊醇的配制31

2.1.2 备择方案1异丙醇沉淀DNA31

2.1.1 基本方案DNA的酚抽提和乙醇沉淀31

2.1.4 辅助方案2丁醇浓缩DNA32

2.1.6 备择方案2玻璃珠法纯化DNA33

2.1.5 辅助方案3醚抽提法去除残存酚、氯仿或丁醇33

2.1.7 备择方案3RNA及DNA稀溶液的纯化和浓缩34

基本方案35

2.2 从哺乳动物组织中制备基因组DNA35

2.1.8 备择方案4乙醇沉淀法去除低分子量的寡核苷酸和核苷三磷酸35

2.3.1 基本方案氯化铯离心法制备植物DNA36

2.3 从植物组织中制备基因组DNA36

2.3.2 备择方案用CTAB制备植物DNA37

2.4.2 备择方案氯化铯法大规模制备细菌基因组DNA39

2.4.1 基本方案细菌基因组DNA的小量制备39

2.4 从细菌中制备基因组DNA39

2.4.3 辅助方案从所得到的基因组DNA制备物中除去多糖40

2.5A.1 基本方案大片段DNA在琼脂糖凝胶上的分离41

2.5A 琼脂糖凝胶电泳41

2.5A.2 辅助方案微型凝胶及中型凝胶42

2.5B.1 基本方案倒转电场凝胶电泳43

2.5B 脉冲场凝胶电泳43

2.5B.2 备择方案钳位均匀电场电泳（CHEF电泳）44

2.5B.3 辅助方案高分子量DNA样品和分子量标准物的制备45

2.6.1 基本方案1琼脂糖凝胶电洗脱46

2.6 从琼脂糖凝胶中分离和纯化大的DNA限制性酶切片段46

2.6.2 基本方案2NA-45纸电泳47

2.6.3 基本方案3用低熔点琼脂糖凝胶分离DNA片段48

2.6.5 备择方案2用玻璃珠法从低熔点琼脂糖凝胶中回收DNA49

2.6.4 备择方案1使用β-琼脂糖酶消化法从低熔点琼脂糖凝胶中回收DNA49

2.7.1 基本方案50

2.7 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳50

2.6.6 辅助方案用溴化乙锭斑点定量法对DNA浓度进行快速估测50

2.7.3 备择方案2DEAE膜电洗脱法纯化标记片段52

2.7.2 备择方案1通过电洗脱从聚丙烯酰胺凝胶纯化片段52

基本方案54

2.8 筛分型琼脂糖凝胶电泳54

2.7.4 辅助方案可重复使用的用于凝胶加样的塑料毛细管54

2.9A.1 基本方案用高盐缓冲液在尼龙膜或硝酸纤维素膜上进行Southern印迹55

2.9A Southern印迹法55

2.9A.2 辅助方案紫外透射仪的校准57

2.9A.4 备择方案2用向下毛细管转移法进行Southern印迹58

2.9A.3 备择方案1用碱性缓冲液在尼龙膜上进行Southern印迹58

2.9A.5 备择方案3从聚丙烯酰胺凝胶至尼龙膜的电转印法59

2.9B.1 基本方案用多样抽滤加样器在不带电荷的尼龙膜和硝酸纤维素膜上进行DNA斑点和狭线印迹60

2.9B DNA的斑点和狭线印迹60

2.9B.2 备择方案1用多样抽滤加样器在带正电荷的尼龙膜上进行DNA斑点和狭线印迹61

2.10 DNA印迹的杂交分析62

2.9B.3 备择方案2DNA斑点印迹的手工制备62

2.10.1 基本方案放射性标记的DNA探针对DNA印迹的杂交分析63

2.10.2 备择方案用放射性标记的RNA探针对DNA印迹进行杂交分析67

2.10.3 辅助方案从杂交膜上除去探针68

基本方案69

2.11 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化寡核苷酸69

第3章 DNA和RNA的酶学操作72

3.1.1 基本方案单酶单DNA样品消化73

3.1 限制性内切酶消化DNA73

3.1.2 备择方案1多限制性内切酶消化DNA样品76

3.1.5 辅助方案DNA的甲基化77

3.1.4 备择方案3限制性内切酶对DNA样品的部分消化77

3.1.3 备择方案2消化多个DNA样品77

基本方案79

3.3 用限制酶部分消化进行DNA作图79

3.2 用多种酶消化进行DNA作图79

基本方案79

3.4.2 10×酶缓冲液80

3.4.1 贮液80

3.4 核酸操作的常用试剂和放射性同位素80

3.4.3 酶反应条件及应用82

3.4.4 核苷三磷酸（NTP）85

基本方案酸沉淀法测定DNA和RNA中的放射性86

3.4.5 标记核酸的放射性同位素86

备择方案柱离心法分离放射性标记DNA87

3.5 依赖于DNA的DNA聚合酶88

基本方案3 随机寡核苷酸引物介导的DNA标记90

基本方案2 修复突出的3′或5′末端以产生平端90

3.5.1 大肠杆菌DNA聚合酶ⅠKlenow片段90

基本方案1 标记DNA的3′末端90

3.5.2 T4DNA聚合酶91

Klenow酶的其他应用91

3.5.3 天然T7DNA聚合酶92

3.5.5 TaqDNA聚合酶93

3.5.4 经修饰的T7DNA聚合酶93

3.6 不依赖于模板的DNA聚合酶末端脱氧核苷酸转移酶（末端转移酶）94

3.7 依赖RNA的DNA聚合酶反转录酶95

噬菌体的RNA聚合酶：SP6、T7和T396

3.8 依赖DNA的RNA聚合酶96

3.10.1 碱性磷酸酶97

3.10 磷酸酶和激酶97

3.9 不依赖DNA的RNA聚合酶*poly（A）聚合酶97

其他应用98

基本方案2 交换反应标记5′端98

3.10.2 T4多核苷酸激酶98

基本方案1 正向反应标记5′端98

3.11.3 双链3′→5′外切核酸酶99

3.11.2 双链5′→3′末端外切核酸酶99

3.11 外切核酸酶99

3.11.1 单链5′→3′和3′→5′外切核酸酶99

3.12.1 Bal31核酸酶100

3.12 内切核酸酶100

3.12.4 微球菌核酸酶101

3.12.3 绿豆核酸酶101

3.12.2 S1核酸酶101

3.12.5 脱氧核糖核酸酶Ⅰ（DNaseⅠ）102

3.13.2 核糖核酸酶H103

3.13.1 核糖核酸酶A（RNaseA）103

3.13 核糖核酸酶103

3.14.1 T4DNA连接酶104

3.14 DNA连接酶104

3.13.3 核糖核酸酶T1104

3.16.1 基本方案105

3.16 DNA片段的亚克隆105

3.14.2 大肠杆菌DNA连接酶105

3.1 5RNA连接酶105

T4RNA连接酶105

3.16.2 备择方案凝胶块中DNA片段的连接107

基本方案 DNA片段亚克隆108

3.17 聚合酶链式反应构建重组DNA108

3.18.1 基本方案1用切口平移法制备生物素酰化的探针112

3.18非同位素探针的标记和比色检测112

3.18.2 基本方案2用随机寡核苷酸引物合成法制备生物素酰化探针113

3.18.3 辅助方案生物素酰化探针的比色法检测114

3.18.4 备择方案制备和检测地高辛标记的DNA探针115

3.19.1 基本方案生物素标记探针的化学发光检测116

3.19 非同位素探针的化学发光检测116

3.19.2 备择方案地高辛标记探针的化学发光检测118

3.19.3 辅助方案紫外光源的标化119

第4章 RNA的制备和分析120

4.1.1 基本方案121

4.1 从组织培养细胞中提取细胞质RNA121

4.1.2 辅助方案除去混杂的DNA污染122

4.2.1 基本方案CsCl法纯化从培养细胞中提取的RNA123

4.2 异硫氰酸胍法制备总RNA123

4.2.2 备择方案1CsCl纯化组织RNA124

4.2.3 备择方案2从组织或培养细胞中一步法分离RNA125

基本方案126

4.3 酚／SDS法制备植物RNA126

4.4.1 基本方案1从革兰氏阴性细菌中分离高质量的RNA127

4.4 制备细菌RNA127

4.4.2 基本方案2从革兰氏阳性细菌分离RNA128

4.4.3 备择方案从革兰氏阴性菌中快速分离RNA129

基本方案130

4.5 poly（A）+RNA的制备130

4.6.1 基本方案用M13模板进行mRNA的S1作图131

4.6 用单链DNA探针进行mRNA的S1核酸酶作图分析131

4.6.3 备择方案2用寡核苷酸探针进行mRNA的定量S1作图分析134

4.6.2 备择方案1从双链模板合成单链探针134

4.6.4 辅助方案S1核酸酶mRNA定量分析的实验对照135

4.7.1 基本方案136

4.7 核酸酶保护试验136

4.7.2 辅助方案1RNA探针的提纯137

基本方案138

4.8 引物延伸138

4.7.3 辅助方案2模板DNA的制备138

4.9.1 基本方案甲醛-琼脂糖凝胶电泳分离RNA的Northern杂交141

4.9 RNA的Northern印迹和狭线杂交分析141

4.9.2 备择方案1经戊二醛／二甲基亚砜变性处理的RNA的Northern杂交144

4.9.3 备择方案2经狭线印迹固定的未分级RNA样品的Northern杂交145

第5章 重组DNA文库的构建147

5.1 基因组DNA文库概述148

5.1.2 亚基因组文库149

5.1.1 表现度与随机性149

5.2 cDNA文库概述150

5.1.3 基因组DNA文库载体150

基本方案151

5.3 噬菌体文库的扩增151

基本方案152

5.4 粘粒和质粒文库的扩增152

第6章 重组DNA文库的筛选154

基本方案156

6.1 噬菌体文库的铺平板和转移156

基本方案158

6.2 粘粒及质粒文库的铺平板和转移158

6.3.1 基本方案在甲酰胺溶液中进行杂交159

6.3 应用DNA片段作探针159

6.4.1 基本方案1在氯化钠／柠檬酸钠溶液（SSC）中杂交160

6.4 使用合成寡核苷酸作探针160

6.3.2 备择方案在水溶液中进行的杂交160

6.4.2 基本方案2在氯化四甲铵（TMAC）中杂交161

6.4.3 辅助方案混合寡核苷酸5′末端标记162

基本方案164

6.5 噬菌体克隆的纯化164

6.7.1 基本方案用抗体筛选λgt11表达文库165

6.7 在λ噬菌体噬斑中产生的融合蛋白的免疫筛选165

6.6 粘粒和质粒克隆的纯化165

基本方案165

6.7.2 备择方案在抗体筛选之前用IPTG诱导融合蛋白表达166

基本方案167

6.8 在杂交选择和翻译后进行的免疫筛选167

6.9.1 YAC文库的构建169

6.9 概述筛选YAC文库和分析YAC克隆的策略169

6.9.3 筛选用的基因座特异性PCR试验的设计171

6.9.2 中心实验室的YAC文库筛选171

6.9.4 分析独立的YAC克隆172

6.10 对分离得到的YAC克隆的分析173

6.9.5 YAC插入片段的亚文库的构建与分析173

6.10.1 基本方案1含YAC的酵母菌株的培养和保存174

6.10.2 基本方案2制备YACDNA进行Southern印迹分析175

6.10.3 基本方案3制备用于脉冲电场凝胶电泳的包埋于琼脂糖胶块中的酵母染色体176

6.10.4 基本方案4用PCR扩增法进行末端片段分析177

6.10.5 备择方案采用亚克隆至细菌质粒载体中分析末端片段180

6.10.6 辅助方案设计和制备pUC19-ES和pUC19-HS亚克隆载体181

6.10.7 基本方案5制备高分子量的含YAC的酵母DNA182

6.10.8 基本方案6制备和分析YAC插入片段的亚文库184

7.0 DNA测序方法概述185

第7章 DNA序列测定185

7.0.1 双脱氧测序（Sanger法）186

7.0.2 化学测序（Maxam-Gilbert法）188

7.0.3 双脱氧法或化学测序法的选择189

7.0.4 放射性标记测序反应的备择标记190

7.1.1 双脱氧测序191

7.1 DNA测序策略191

7.1.2 化学测序192

7.2.1 基本方案1用外切酶Ⅲ构建单向缺失突变体194

7.2 构建用于DNA测序的嵌套式缺失突变体194

7.2.3 基本方案2用Bal31核酸酶构建嵌套式缺失突变体198

7.2.2 辅助方案1用［α-35S］dNTP使DNA免于外切酶Ⅲ消化198

7.2.4 辅助方案制备M13mp测序载体以亚克隆Bal31消化的DNA片段203

7.3.1 基本方案1制备单链M13噬菌体DNA204

7.3 制备DNA测序模板204

7.3.2 基本方案2从小量裂解物中制备λ噬菌体DNA205

7.3.3 基本方案3小量制备用于双脱氧测序的双链质粒DNA模板206

7.3.5 基本方案5制备用于热循环测序质粒或噬菌体DNA207

7.3.4 基本方案4用于双脱氧测序的双链质粒DNA的碱变性207

7.4 双脱氧法DNA测序208

7.4.1 基本方案1用测序酶进行标记／终止测序反应209

7.4.3 备择方案2使用TaqDNA聚合酶进行Sanger双脱氧测序213

7.4.2 备择方案1使用Mn2+的标记／终止反应213

7.4.4 备择方案3用5′末端标记引物一步法进行测序反应214

7.4.5 基本方案2用α-标记核苷酸进行热循环测序反应215

7.5 化学发光双脱氧DNA测序法218

7.4.6 备择方案4用5′末端标记引物进行热循环测序反应218

7.5.1 基本方案利用生物素标记引物的化学发光DNA测序法220

7.5.3 备择方案2用半抗原标记引物进行测序并用抗体碱性磷酸酶偶联物进行检测222

7.5.2 备择方案1链亲和素和生物素酰化碱性磷酸酶两步检测法（间接法）222

7.6.1 基本方案测序胶的灌制、电泳及处理224

7.6 用于测序的变性凝胶电泳224

7.6.2 备择方案1缓冲液梯度测序胶227

7.6.3 备择方案2电解质梯度测序胶228

7.7.1 序列数据的录入229

7.7 DNA和蛋白质序列的计算机处理和分析229

7.6.4 备择方案3含甲酰胺的测序胶229

7.7.2 序列数据的确证和组装232

7.7.3 限制酶作图235

7.7.4 核酸结构预测236

7.7.5 寡核苷酸设计策略237

7.7.6 蛋白质编码区的识别239

7.7.7 同源性检索240

附录243

7.7.8 向分子生物学家提供的基因序列库及其他计算机资源243

第8章 克隆化DNA的诱变252

基本方案253

8.1 无需表型选择的寡核苷酸介导的诱变253

8.2A 用简并寡核苷酸诱变：在小段DNA序列中产生大量突变256

基本方案256

基本方案259

8.2B 基因合成：用互为引物的长段寡核苷酸合成目的序列259

8.3.1 基本方案260

8.3 区域特异性诱变260

8.4.1 辅助方案用嵌套缺失体和互补寡核苷酸进行接头分区诱变263

8.4 DNA的接头分区诱变263

8.3.2 辅助方案突变克隆的富集263

8.4.2 备择方案寡核苷酸介导的接头分区诱变265

8.5.1 基本方案1通过PCR引入限制性内切酶位点266

8.5 利用聚合酶链式反应（PCR）的定点诱变266

8.5.2 基本方案2利用PCR引入点突变268

8.5.3 备择方案通过顺序PCR步骤引入点突变271

第9章 DNA导入哺乳动物细胞274

9.1.1 基本方案磷酸钙-DNA在HEPES中形成沉淀的转染方法277

9.1 磷酸钙转染法277

9.1.3 备择方案在BES中形成磷酸钙-DNA沉淀的高效转染方法279

9.1.2 辅助方案1哺乳动物细胞的甘油／二甲基亚砜休克279

9.1.4 辅助方案2质粒DNA的纯化280

9.2.1 基本方案281

9.2 利用DEAE-葡聚糖的转染281

9.2.3 备择方案2悬浮细胞的转染283

9.2.2 备择方案1DEAE-葡聚糖大批量转染283

9.3.1 基本方案电穿孔法转染哺乳动物细胞284

9.3 电穿孔转染法284

9.2.4 备择方案3用氯喹处理细胞284

9.3.2 备择方案植物原生质体细胞的电穿孔转染285

9.4.1 基本方案用脂质体介导短暂表达286

9.4 脂质体介导的转染286

9.5.1 基本方案287

9.5 将基因稳定转染至哺乳动物细胞287

9.4.2 备择方案用脂质体进行稳定转染287

9.5.2 哺乳动物细胞的选择标记288

9.6 遗传报道基因系统概述290

9.6.1 报道载体的设计294

9.6.2 体外报道分子分析方法295

9.6.3 体内报道分子分析方法298

9.7A.1 基本方案1CAT活性的层析分析法299

9.7A 报道基因活性的同位素分析方法299

9.7A.3 备择方案2CAT活性的相-抽提分析法302

9.7A.2 备择方案1原位裂解细胞的CAT分析方法302

9.7A.4 基本方案2人生长激素的放射免疫分析法303

9.7B.1 基本方案1萤火虫荧光素酶报道基因分析305

9.7B 非同位素分析报道基因活性305

9.7B.2 备择方案冻融裂解的细胞的荧光素酶分析306

9.7B.3 基本方案2β-半乳糖苷酶报道基因的化学发光分析307

9.8.1 转染效率308

9.8 转染后RNA的直接分析308

9.9.1 DEAE-葡聚糖转染法309

9.9 转染条件的优化309

9.8.2 RNA制备309

9.8.3 RNA分析309

9.8.4 启动子强度309

9.9.2 磷酸钙转染法310

9.9.4 脂质体介导的转染311

9.9.3 电穿孔法311

9.10.1 反转录病毒生活周期312

9.10 反转录病毒转导系统概述312

9.10.4 包装细胞系和病毒的产生315

9.10.3 有复制能力的载体315

9.10.2 无复制能力的载体315

9.10.5 安全性问题316

9.11.1 基本方案1将反转录病毒载体导入包装细胞系317

9.11 建立特异的反转录病毒产毒细胞系317

9.11.2 基本方案2测定病毒滴度：高滴度产病毒细胞克隆的鉴定319

9.11.3 备择方案产毒克隆的快速评价320

9.12.1 基本方案用离心法制备和浓缩病毒原液321

9.12 大规模制备和浓缩反转录病毒原液321

9.11.4 辅助方案培养细胞的Xgal染色321

9.12.2 备择方案用聚乙二醇均相沉淀及层析法浓缩病毒322

9.13 反转录病毒原液中辅助病毒的检测323

9.12.3 备择方案用分子量截留滤膜进行浓缩323

9.13.1 基本方案通过药物抗性的水平传播分析辅助病毒324

9.13.2 备择方案用反转录酶分析法检测辅助病毒325

9.14.2 在体内感染啮齿类动物326

9.14.1 体外细胞感染326

9.14 用反转录病毒在体外及体内感染细胞326

第10章 蛋白质的分析329

基本方案Bradford法332

10.1 比色法测定蛋白质含量332

10.2.1 电与电泳333

10.2 蛋白质的单向SDS凝胶电泳333

10.2.2 基本方案1变性（SDS）不连续凝胶电泳：Laemmli凝胶电泳法334

10.2.3 备择方案1在Tris-Tricine缓冲系统中电泳338

10.2.4 备择方案2在无尿素条件下用Tris缓冲液分离多肽340

10.2.5 备择方案3连续SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳341

10.2.6 备择方案4超薄凝胶的灌制和电泳342

10.2.7 辅助方案1一次灌制多块浓度均一的凝胶343

10.2.8 备择方案5在梯度凝胶中分离蛋白质345

10.2.9 辅助方案2一次灌制多块梯度胶347

10.2.1 0基本方案2在均一浓度的微型凝胶上电泳349

10.2.1 1辅助方案3制备多块梯度胶351

10.3 使用O’Farrell系统的双向凝胶电泳352

10.3.1 基本方案1第1向凝胶（等电聚焦）353

10.3.2 基本方案2第2向凝胶354

10.3.3 备择方案1、2（第1向凝胶电泳）极端碱性、酸性蛋白的等电聚焦356

10.3.5 辅助方案组织来源的蛋白质样品的溶解和制备357

10.3.4 备择方案3小型凝胶双向电泳357

基本方案358

10.4 从已染色的凝胶中电洗脱回收蛋白质358

10.5.1 基本方案1考马斯亮蓝染色360

10.5 凝胶中蛋白质的染色360

10.5.2 基本方案2银染法361

10.5.3 备择方案非氨盐银染法362

10.5.4 基本方案3快速银染法363

10.6.1 基本方案印度墨汁染色364

10.6 检测转印到膜上的蛋白质364

10.5.5 辅助方案凝胶拍照364

10.6.3 辅助方案碱处理增强蛋白质的染色365

10.6.2 备择方案金染色365

10.7.1 基本方案1用转移槽转印蛋白质366

10.7 免疫印迹与免疫检测366

10.7.2 备择方案1用半干转移系统转印蛋白质368

10.7.4 基本方案2用第二抗体偶联物进行免疫检测369

10.7.3 辅助方案转印后蛋白质的可逆染色369

10.7.6 基本方案3用发色底物显迹371

10.7.5 备择方案2用亲和素-生物素偶联的第二抗体进行免疫检测371

10.8 凝胶过滤层析373

10.7.7 备择方案3用发光底物显迹373

10.8.1 基本方案蛋白质的凝胶过滤分离374

10.8.3 辅助方案凝胶介质和层析柱的选择376

10.8.2 备择方案蛋白质的凝胶过滤脱盐376

10.9.1 基本方案377

10.9 离子交换层析377

10.9.2 辅助方案离子交换层析介质和层析柱的选择379

10.10.1 基本方案可溶性抗原或膜结合抗原的分离380

10.10 免疫亲和层析380

10.10.3 备择方案2低pH洗脱抗原382

10.10.2 备择方案1抗原的批处理纯化382

10.11.1 基本方案天然MCAC纯化带组氨酸尾的可溶性融合蛋白383

10.11 金属螯合亲和层析383

10.11.2 备择方案1变性条件下用MCAC纯化带组氨酸尾的不溶性融合蛋白386

10.11.4 辅助方案1已纯化蛋白的分析和处理387

10.11.3 备择方案2MCAC纯化蛋白的固相复性387

10.12.1 基本方案多肽和蛋白质的分离388

10.12 反相高效液相层析388

10.11.5 辅助方案2NTA介质的再生388

10.12.3 辅助方案水、缓冲液和溶剂的脱气390

10.12.2 备择方案蛋白质的分离390

10.13 离子交换高效液相层析391

10.13.1 基本方案1阴离子交换HPLC392

基本方案393

10.14 分子排阻高效液相层析393

10.13.2 基本方案2阳离子交换HPLC393

10.15.1 基本方案用抗体-Sepharose偶联物免疫沉淀放射性标记抗原394

10.15 免疫沉淀法394

10.15.2 辅助方案制备抗体-Sepharose偶联物396

10.15.3 备择方案1用抗Ig血清免疫沉淀放射性标记抗原397

10.15.4 备择方案2用抗Ig抗体-Sepharose、蛋白A-或蛋白G-Sepharose或金黄色葡萄球菌（S.aureus）免疫沉淀放射性标记抗原398

10.15.6 备择方案4用抗体-Sepharose琼脂糖偶联物免疫沉淀非标记抗原399

10.15.5 备择方案3使用更剧烈的解离和洗涤条件的免疫沉淀399

基本方案400

10.16 克隆化基因的体外转录和翻译400

10.17.1 基本方案用［35S］甲硫氨酸短时间标记悬液中的细胞402

10.17 蛋白质的生物合成标记402

10.17.3 备择方案2用［35S甲硫氨酸长时间标记细胞404

10.17.2 备择方案1用［35S］甲硫氨酸短时间标记贴壁培养细胞404

10.17.5 备择方案4用其他氨基酸进行生物合成标记405

10.17.4 备择方案3用［35S］甲硫氨酸对细胞进行脉冲追踪标记405

10.18.1 基本方案1测定在PVDF膜上样品的氨基酸序列406

10.18 分离蛋白质用于微量序列分析406

10.17.6 辅助方案TCA沉淀法确定放射性标记的掺入量406

10.18.2 辅助方案SDS-PAGE准备蛋白质样品408

10.18.3 基本方案2测定N-末端封闭蛋白质的内部序列409

第11章 免疫学411

11.1.1 基本方案辣根过氧化物酶（HRPO）与抗体的偶联413

11.1 酶与抗体的偶联413

11.2 酶联免疫吸附测定（ELISA）414

11.1.2 备择方案碱性磷酸酶与抗体的偶联414

11.2.1 基本方案用间接ELISA法检测特异性抗体415

11.2.2 备择方案1直接竞争ELISA法检测可溶性抗原417

11.2.3 备择方案2抗体夹心ELISA法检测可溶性抗原418

11.2.4 备择方案3双抗体夹心ELISA法检测特异性抗体419

11.2.5 备择方案4直接细胞ELISA法检测细胞表面抗原421

11.2.6 备择方案5间接细胞ELISA法检测对表面抗原具有特异性的抗体422

11.2.7 辅助方案1交叉连续稀释法确定最佳试剂浓度424

11.2.8 辅助方案2制备细菌细胞裂解物抗原425

11.3.1 基本方案1单克隆抗体上清的制备426

11.3 单克隆抗体上清液和腹水的制备426

11.3.2 备择方案1单克隆抗体上清的大量制备427

11.3.4 基本方案2含单克隆抗体的腹水的制备428

11.3.3 备择方案2大量制备杂交瘤或细胞系428

11.4.1 基本方案用蛋白A-Sepharose进行纯化430

11.4 单克隆抗体的纯化430

11.4.3 备择方案2用抗原-Sepharose和抗鼠Ig-Sepharose进行纯化431

11.4.2 备择方案1蛋白A-Sepharose的备择缓冲液系统431

11.5 兔多克隆抗血清的制备432

11.5.1 基本方案肌肉内注射免疫法433

11.5.3 备择方案2皮下组织注射免疫法434

11.5.2 备择方案1皮内注射免疫法434

11.6 从抗血清、腹水或杂交瘤上清液中纯化IgG抗体435

11.5.4 备择方案3耳动脉放血435

11.6.2 备择方案用DEAE-Affi-Gel-Blue层析法分级分离IgG436

11.6.1 基本方案用硫酸铵沉淀IgG436

11.7 免疫原性肽的选择437

11.8.1 基本方案通过化学偶联法用MBS将合成肽偶联到担体蛋白上439

11.8 抗肽抗体的制备439

11.8.2 备择方案用戊二醛将合成肽通过化学偶联法偶联到担体蛋白质上440

第12章 DNA-蛋白质相互作用442

12.1.1 基本方案核提取物的制备444

12.1 从哺乳动物细胞中制备核提取物和细胞质提取物444

12.1.2 辅助方案1细胞核提取方法的优化446

12.2.1 基本方案低离子强度聚丙烯酰胺电泳迁移率变动分析447

12.2 DNA结合蛋白在凝胶电泳中的迁移率变动分析447

12.1.3 辅助方案2细胞质（S-100）组分的制备447

12.3 甲基化干扰分析法和尿嘧啶干扰分析法449

12.2.2 备择方案高离子强度聚丙烯酰胺电泳迁移率变动分析449

12.3.1 基本方案1甲基化干扰分析法450

12.3.2 基本方案2尿嘧啶干扰分析法451

12.4.1 基本方案DNA酶Ⅰ足迹分析法453

12.4 DNA酶Ⅰ足迹分析法453

12.4.2 辅助方案用光密度及数值分析法决定蛋白质结合的平衡常数456

12.4.3 备择方案粗制品的DNA酶Ⅰ足迹分析法458

12.5.1 基本方案用溴脱氧尿苷（BrdU）取代的探针进行紫外交联459

12.5 蛋白质与核酸的紫外交联459

12.5.2 备择方案1用非溴脱氧尿苷（NON-BrdU）取代的探针进行紫外交联461

12.6.1 基本方案462

12.6 用生物素／链亲和素亲和系统纯化DNA结合蛋白462

12.5.3 备择方案2原位紫外交联462

12.6.2 备择方案1用微型柱进行纯化464

12.7.1 基本方案用识别位点DNA筛选λgt11表达文库465

12.7 编码DNA结合蛋白的cDNA的检测、纯化和鉴定465

12.6.3 备择方案2用链亲和素-琼脂糖进行纯化465

12.7.2 备择方案干燥膜的变性／复性467

12.7.3 辅助方案从重组溶原菌中制备粗提物鉴定DNA结合蛋白的活性468

基本方案469

12.8 用体外合成的蛋白质分析DNA蛋白质相互作用469

12.9.1 基本方案1DNA亲和介质的制备470

12.9 序列特异性DNA结合蛋白的亲和层析纯化470

12.9.2 备择方案将DNA偶联于溴化氰活化琼脂糖上473

12.9.3 辅助方案1用制备性凝胶电泳纯化寡核苷酸474

12.9.4 基本方案2DNA亲和层析法475

12.9.5 辅助方案2非同位素竞争性DNA的选择和制备477

第13章 酿酒酵母479

13.1 酵母菌培养基的制备480

13.1.1 液体培养基481

13.1.2 固体培养基483

13.2 酵母菌的培养与操作486

基本方案冷冻菌种保存液的制备与接种486

13.1.3 菌株的保存与复苏486

13.2.3 基本方案3细胞密度检测487

13.2.2 基本方案2固体培养基培养酵母菌487

13.2.1 基本方案1液体培养基培养酵母菌487

13.2.6 基本方案6二倍体细胞的孢子形成488

13.2.5 基本方案5二倍体细胞的构建488

13.2.4 基本方案4影印平板检测酵母菌表型488

13.2.7 基本方案7四分体的制备与剖分489

13.2.8 辅助方案解剖针的制作491

13.2.9 备择方案随机孢子分析492

13.3.1 基本方案甲乙硫醚诱变493

13.3 酵母菌细胞的诱变493

13.4 酵母菌的克隆载体与基因图谱495

13.3.2 备择方案紫外光诱变495

13.4.1 质粒分类命名499

13.4.2 精选的质粒和基因图谱503

13.5 酵母菌表达载体504

13.6.1 基本方案1研究基因调控的lacZ融合载体507

13.6 酵母菌载体与表达产物的检测507

13.6.2 基本方案2β-半乳糖苷酶在液体培养基中的表达与检测508

13.7.1 基本方案乙酸锂转化509

13.7 将DNA导入酵母菌细胞中509

13.7.2 备择方案1原生质体转化510

13.7.3 备择方案2电穿孔转化512

13.7.4 辅助方案单链高分子量的担体DNA的制备514

基本方案515

13.8 利用互补作用克隆酵母菌基因515

基本方案516

13.9 酵母细胞的质粒分离除去516

13.10.1 基本方案1整合性转化517

13.10 克隆化酵母DNA的操作517

基本方案3基因破坏一步法518

基本方案2整合性破坏518

13.10.2 基因置换技术518

基本方案4移换519

13.10.3 基本方案5质粒缺口修复520

13.10.4 基本方案6穿梭质粒521

13.11.1 基本方案从酵母菌中快速分离质粒DNA522

13.11 酵母DNA的制备522

13.11.2 备择方案酵母染色体DNA的快速分离523

13.12.1 基本方案热酸性酚抽提法制备酵母RNA524

13.12 酵母菌RNA的制备524

13.12.3 备择方案2poly（A）+RNA的制备525

13.12.2 备择方案1玻璃珠法制备RNA525

13.13.1 基本方案原生质体制备及裂解526

13.13 制备酵母蛋白抽提物526

13.13.2 辅助方案差速离心法制备细胞核527

13.13.3 备择方案1玻璃珠破细胞法528

13.13.4 备择方案2液氮破细胞法529

13.14 利用相互作用阱／双杂合系统确定相互作用的蛋白质530

13.14.1 基本方案1鉴定诱饵蛋白的特性531

13.14.2 基本方案2相互作用蛋白的捕获534

13.14.3 辅助方案1制备鲑精担体DNA537

13.14.4 辅助方案2附加的特异性筛选方法538

14.1 组织、胚胎及单细胞的固定、包埋及切片539

第14章 原位杂交和免疫组织化学539

14.1.1 基本方案组织和胚胎的多聚甲醛固定及石蜡包埋540

14.1.2 备择方案悬浮及培养细胞的PFA固定541

14.1.4 辅助方案2蜡块中样品的切片542

14.1.3 辅助方案1成年小鼠的灌流542

14.2.1 基本方案样品制备及切片544

14.2 冰冻切片544

14.1.5 辅助方案3预包被载玻片的处理544

14.2.2 辅助方案1用于原位杂交的冰冻切片的固定547

14.2.3 辅助方案2组织固定和蔗糖浸制548

14.3.1 基本方案石蜡切片或细胞的杂交实验549

14.3 细胞RNA的原位杂交549

14.3.2 备择方案冰冻切片的杂交实验552

14.3.3 辅助方案135S标记的核糖核酸探针和含硫探针竞争剂的合成554

14.4.2 基本方案2胶乳放射自显影555

14.4.1 基本方案1胶片放射自显影555

14.3.4 辅助方案235S标记的双链DNA探针的合成555

14.4 杂交探针的检测555

14.4.3 辅助方案放射自显影用稀释胶乳的制备556

14.5.1 基本方案吉姆萨（Giemsa）染色法557

14.5 放射自显影原位杂交玻片的复染和压片固定557

14.5.2 备择方案1苏木精／伊红染色法558

14.5.4 备择方案3HOECHST染色法559

14.5.3 备择方案2甲苯胺蓝染色法559

14.6 免疫组织化学法560

14.6.1 基本方案1单层生长细胞的免疫荧光标记561

14.6.2 备择方案1悬浮细胞的免疫荧光标记562

14.6.3 基本方案2组织切片的免疫荧光标记563

14.6.4 备择方案2链亲和素-生物素结合物免疫荧光标记法564

14.6.7 备择方案5组织切片的免疫荧光双标记法565

14.6.6 备择方案4组织切片的免疫过氧化物酶标记565

14.6.5 备择方案3组织切片的免疫金标记565

14.7 用非同位素探针进行原位杂交和检测566

14.7.1 基本方案1荧光原位杂交567

辅助方案1 生物素酰化信号的放大569

14.7.2 杂交信号的放大569

14.7.3 非同位素标记探针的酶法检测570

辅助方案2 地高辛标记探针的信号放大570

备择方案1 辣根过氧化物酶法检测571

备择方案2 碱性磷酸酶检测法572

14.8.1 总体设计573

14.8 低丰度核酸的检测：原位PCR和杂交573

14.8.2 基本方案1DNA和RNA靶序列的原位PCR扩增576

14.8.3 备择方案一步法反转录及扩增579

14.8.4 基本方案2ISPCR扩增的产物的杂交和检测580

14.8.6 辅助方案2在载玻片上制备原位PCR样品584

14.8.5 辅助方案1AES浸泡处理载玻片的制备584

14.8.7 辅助方案3用33P标记寡核苷酸探针585

第15章 聚合酶链式反应（PCR）587

基本方案589

15.1 PCR扩增DNA：标准程序和优化589

15.2.2 备择方案1单引物重复扩增制备单链模板以用于双脱氧测序592

15.2.1 基本方案1不对称PCR产生的单链产物的双脱氧测序592

15.2 利用PCR产物直接进行DNA序列测定592

15.2.3 备择方案2制备用于双脱氧测序的双链PCR产物593

15.2.5 基本方案2PCR产物的标记和化学测序594

15.2.4 备择方案3用λ噬菌体核酸外切酶消化双链PCR产物得到单链进行双脱氧测序594

15.2.6 备择方案4PCR产物的基因组测序595

基本方案596

15.3 通过PCR方法对微量DNA进行定量分析596

15.4.1 基本方案在最适条件下进行RNA的PCR扩增598

15.4 PCR扩增RNA598

15.4.3 备择方案2将cDNA直接用于扩增反应600

15.4.2 备择方案1避免长时间的共沉淀及退火步骤的方法600

15.5.1 基本方案连接介导的单侧PCR601

15.5 用于基因组测序及足迹分析的连接介导PCR601

15.4.4 辅助方案粗制RNA的快速提取601

15.5.2 辅助方案1从单层细胞制备基因组DNA以用于DMS足迹分析605

15.5.3 辅助方案2从悬浮细胞中制备用于DMS足迹分析的基因组DNA608

15.5.4 辅助方案3用于化学测序的基因组DNA的制备609

15.6.1 基本方案1扩增已知序列的下游（3′端）区段611

15.6 利用单侧PCR（锚式PCR）进行cDNA扩增611

15.6.2 基本方案2扩增已知序列上游（5′端）区段613

15.7.1 基本方案产生T-A突出端616

15.7 PCR产物的分子克隆616

15.7.2 备择方案1产生半位点618

基本方案619

15.8 通过PCR差异展示mRNA619

第16章 蛋白质的表达625

16.1.1 用大肠杆菌进行基因表达的一般策略626

16.1 概述：蛋白质在大肠杆菌中表达626

16.1.2 特定的表达方案627

16.1.3 基因表达的疑难分析628

16.2.1 基本方案用双质粒系统进行表达629

16.2 T7RNA聚合酶／启动子表达系统629

16.2.2 备择方案1质粒编码蛋白的选择性标记631

16.3 用带λ噬菌体调节序列的载体进行表达632

16.2.3 备择方案2通过M13噬菌体mGP1-2感染的表达632

16.3.1 基本方案1基因表达的温度诱导633

16.3.3 辅助方案1用pSKF系列载体进行“天然基因”克隆634

16.3.2 基本方案2基因表达的化学诱导634

16.3.4 辅助方案2融合基因在pSKF301中的构建和拆分636

16.4 融合蛋白载体表达概述638

16.4.1 表达蛋白的可溶性639

16.4.3 裂解融合蛋白以除去担体蛋白640

16.4.2 表达蛋白的稳定性640

16.5.1 基本方案1用Xa因子进行融合蛋白的酶解641

16.5 融合蛋白的酶解和化学裂解641

16.5.3 备择方案1用凝血酶进行融合蛋白的酶解642

16.5.2 辅助方案用Xa因子进行变性融合蛋白的裂解642

16.5.4 备择方案2与分离介质结合的GST融合蛋白的酶解643

16.5.5 备择方案3用肠激酶进行融合蛋白的酶解644

16.5.7 备择方案4用羟胺化学裂解融合蛋白645

16.5.6 基本方案2用溴化氰对融合蛋白进行化学降解645

16.5.8 备择方案5低pH下水解融合蛋白进行化学裂解646

基本方案647

16.6 lacZ和trpE融合蛋白的表达及纯化647

基本方案649

16.7 谷胱甘肽S-转移酶融合蛋白的表达及纯化649

16.8.1 基本方案硫氧还蛋白融合蛋白的构建和表达652

16.8 硫氧还蛋白融合蛋白的表达和纯化652

16.8.2 辅助方案1用弗氏细胞压碎器裂解大肠杆菌655

16.8.4 辅助方案3用热处理纯化硫氧还蛋白融合蛋白657

16.8.3 辅助方案2硫氧还蛋白融合蛋白的渗透性释放657

16.9.1 杆状病毒表达系统658

16.9 杆状病毒表达系统的概述658

16.9.4 用于杆状病毒表达系统的试剂、溶液和设备660

16.9.3 用杆状病毒表达系统超量表达蛋白的步骤660

16.9.2 昆虫细胞中蛋白质的翻译后修饰660

16.10.1 基本方案1昆虫细胞的保存和培养662

16.10 昆虫细胞培养物及杆状病毒毒种贮液的制备662

16.10.2 基本方案2杆状病毒毒种贮液的制备663

16.10.3 辅助方案用蚀斑试验测定病毒贮液的滴度664

16.11重组杆状病毒的产生和重组蛋白的表达分析666

16.11.1 基本方案1用野生型病毒线性化DNA共转染667

16.11.2 备择方案用野生型病毒环状DNA共转染669

16.11.3 辅助方案1野生型杆状病毒的纯化670

16.11.4 基本方案2编码β-半乳糖苷酶的重组杆状病毒的纯化671

16.11.5 辅助方案2裸眼筛选重组杆状病毒672

16.11.6 基本方案3重组病毒的蛋白质分析673

16.11.7 辅助方案3重组蛋白质的代谢标记674

16.11.8 辅助方案4蛋白质生产高峰期的确定675

16.11.9 基本方案4重组蛋白质的大规模生产676

16.12.1 病毒介导的基因转移677

16.12 概述：蛋白质在哺乳动物细胞中表达677

16.12.3 DNA的稳定转染678

16.12.2 短暂表达678

16.12.7 问题的发现与解决679

16.12.6 表达系统的选择679

16.12.4 转染DNA的扩增679

16.12.5 表达载体679

基本方案680

16.13 用COS细胞短暂表达蛋白质680

17.1 蛋白质磷酸化概述683

第17章 蛋白质磷酸化的分析683

17.2.1 基本方案培养细胞的32Pi标记和温和去污剂裂解法684

17.2 培养细胞用32Pi标记和用于免疫沉淀的细胞裂解物的制备684

17.2.2 备择方案SDS煮沸法裂解细胞686

17.3.1 基本方案磷酸氨基酸的酸水解和双向电泳分析687

17.3 磷酸氨基酸分析687

17.4 分析非标记蛋白质的磷酸化作用691

17.3.2 备择方案碱处理提高转移至滤膜上的磷酸酪氨酸和磷酸苏氨酸的检测691

17.4.1 基本方案1用抗磷酸酪氨酸抗体和［125I］标记蛋白A进行免疫印迹分析692

17.4.2 备择方案用增强化学发光法（ECL）检测结合的抗体693

17.4.3 基本方案2磷酸酶消化法鉴定磷酸化的蛋白质694

附录1 试剂和溶液696

附录696

附录2 标准测量值、数据和缩写795

常用缩写795

实用测量值和数据801

核酸的特性807

放射性817

离心机和转子819

附录3 生物化学和分子生物学常用技术823

附录3A 放射自显影823

附录3B 玻璃器皿的硅化825

附录3C 透析与超滤826

附录3D 用吸收光谱法和荧光光谱法定量DNA和RNA831

附录3E 通过沉默突变引入限制性酶切位点835

附录4 试剂和设备的供应商838

附录5 参考文献846

致谢858