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第一章概论1

第一节 EIA技术基本原理1

第二节 EIA研究历史和发展动态2

第三节EIA技术的优缺点7

一、EIA技术的优越性7

（一）灵敏度高8

（二）特异性强8

（三）对仪器设备要求不高，测定成本低8

（四）方法快速、简便8

（五）试剂保存时间较长9

（六）自动化程度高9

（七）方法种类多9

（八）无放射性同位素污染9

二、EIA技术的潜在危害10

（一）准备建立EIA方法时可能遇到的危险10

（二）EIA操作过程中的危害性10

第四节EIA技术在生物科学中的应用前景12

一、在医学与兽医学领域的应用前景12

（一）疾病诊断12

（二）流行病学调查13

（三）妊娠诊断13

（四）排卵期预测13

二、在畜牧学科中的应用前景13

（一）家畜育种学13

（二）家畜繁殖学14

（三）家畜饲养与饲料生产学14

（四）其他14

三、在植物学科中的应用前景14

（一）植物育种14

（二）在植物保护和植物生理学研究中的应用前景15

四、在食品工业中的应用前景16

（一）食品中有毒有害物质的监测16

（二）肉品蛋白质的鉴别16

五、在环境保护学科中的应用前景17

主要参考文献18

第二章EIA方法的分类和工作原理及其基本操作条件21

第一节根据酶促反应特点分类21

一、AA型EIA方法22

（一）半抗原测定22

（二）抗原测定23

（三）抗体测定24

二、AM型EIA方法24

（一）邻连酶系统25

（二）抗体掩盖或增强酶活性25

（三）抗体掩盖酶底物26

（四）抗体掩盖酶的辅因子或辅酶27

（五）抗原直接调节酶活性27

（六）亲和素调节酶活性28

三、混合型或顺序型28

四、AA型与AM型方法的特点比较28

（一）灵敏度28

（二）特异性29

（三）准确性29

（四）操作速度和简便性29

第二节根据抗原-抗体反应动力学分类30

一、竞争性EIA30

二、非竞争性EIA31

第三节根据抗原和抗体在反应体系中的存在方式分类31

一、固相EIA方法31

（一）ELISA法32

（二）DASS法32

二、液相EIA方法33

（一）双抗体法33

（二）HEIA法34

第四节根据反应体系与检测体系之间的关系分类34

一、直接法36

二、间接法36

第五节建立EIA方法应具备的条件36

一、基本条件37

（一）免疫原37

（二）标准品37

（三）抗体38

（四）分离技术38

（五）酶标记物38

（六）酶底物系统38

（七）检测酶活性的仪器39

（八）加样器及其他设备39

（九）缓冲液39

二、自动化操作条件39

（一）自动加样设备40

（二）自动清洗仪40

（三）自动读数器40

主要参考文献40

第三章酶与底物系统42

第一节酶促反应基本原理42

一、酶的催化特性43

二、单底物酶的催化特性44

三、复合底物酶促反应的动力学47

四、米-曼氏常数的测定方法48

五、酶活性的抑制52

第二节影响酶促反应的因素54

一、温度54

二、溶液pH55

三、缓冲液成分和离子强度56

四、固相载体56

第三节酶活性测定60

一、酶活性与纯度的关系60

二、配对酶的活性测定61

三、循环酶系统中酶活力的测定62

四、酶活性的光度测定63

第四节EIA中常用的酶及其底物系统64

一、用于AA型EIA中的酶67

（一）辣根过氧化物酶67

（二）β-半乳糖苷酶85

（三）碱性磷酸酶88

（四）葡萄糖氧化酶（GO酶）95

（五）脲酶99

二、用于活性调节EIA方法中的酶101

（一）溶菌酶101

（二）苹果酸脱氢酶105

（三）葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（GPD酶）107

（四）核糖核酸酶（RNA酶）110

主要参考文献110

第四章抗体理化特性和制备方法114

第一节抗体的性质114

一、抗体的概念和分类114

（一）抗体的概念114

（二）抗体的分类114

二、抗体的化学性质和基本结构117

三、哺乳动物的抗体121

四、禽类抗体122

第二节抗体形成的基本原理123

一、产生抗体的细胞124

二、抗体的产生及其一般规律126

三、抗体生成的调节和免疫耐受128

（一）免疫调节128

（二）免疫耐受130

第三节多克隆抗体的制备131

一、制备多克隆抗体的条件131

（一）免疫原131

（二）佐剂133

（三）用于免疫的动物133

二、免疫操作程序134

（一）免疫原与佐剂的乳化135

（二）注射乳化液的方法（初次免疫）136

（三）加强免疫137

（四）血液收集137

第四节单克隆抗体的制备139

一、单克隆抗体的生产原理141

二、制备单克隆抗体的操作流程143

（一）免疫动物和骨髓瘤细胞系的选择143

（二）脾脏细胞和饲养细胞的制备147

（三）融合和融合剂149

（四）杂交瘤细胞的筛选与选择培养基的配制150

（五）抗体检测153

（六）杂交瘤细胞的克隆化153

（七）单克隆抗体的生产156

（八）杂交瘤细胞的冷冻保存156

（九）体外免疫法制备单克隆抗体157

第五节IgG的分离和Fab片段的制备157

一、多克隆抗血清中免疫球蛋白的分离158

（一）污染蛋白质的选择性沉淀158

（二）盐析159

（三）离子交换层析法162

（四）亲和层析法提纯IgG167

二、从卵黄中分离IgY176

三、单克隆抗体的纯化176

四、免疫球蛋白的纯度和质量鉴定177

五、Fab片段的制备和纯化177

（一）水解蛋白质的常用方法178

（二）Fab片段和Fab片断的纯化180

第六节抗体的半抗原化181

一、抗体半抗原化的原理181

二、抗体半抗原化的方法183

主要参考文献186

第五章两种物质的偶联189

第一节偶联的基本原理189

一、偶联方法简介189

二、偶联条件的选择191

（一）被偶联的两种物质的浓度及其相对比率191

（二）偶联剂的选择196

（三）缓冲液的选择197

第二节两种大分子物质的偶联198

一、化学偶联198

（一）戊二醛法199

（二）过碘酸钠法204

（三）对苯醌法211

（四）邻苯二马莱酰亚胺法（OPDM法）213

（五）BSNHS法220

（六）TDIC法221

（七）FNPS法223

（八）CDI法224

（九）NHS法225

（十）NHS-FBA法230

（十一）SPDP法232

二、免疫学偶联233

（一）各种抗体的制备235

（二）免疫复合物的制备236

（三）免疫复合物中酶与抗体克分子比例的计算238

三、化学-生物学偶联239

第三节大分子与小分子的偶联242

一、建立偶联方法的基本要求243

（一）载体蛋白和半抗原分子中反应基团的选择243

（二）偶联剂的选择246

（三）偶联条件的选择247

（四）蛋白质分子中的基团数及其估算方法251

（五）半抗原与蛋白质偶联比率的确定252

二、各种半抗原与蛋白质的偶联253

（一）分子中含羟基或可羟化的半抗原的偶联253

（二）含氨基或可还原硝基半抗原的偶联256

（三）含巯基半抗原的偶联257

（四）含羟基半抗原的偶联258

（五）含醛基或酮基半抗原的偶联260

（六）其他半抗原的偶联260

第四节偶联物的纯化和保存263

一、偶联物的纯化原理263

（一）离心法264

（二）透析法264

（三）层析法265

二、偶联物的保存原理266

三、大分子-大分子偶联物的纯化和保存268

（一）过氧化物酶-IgG的纯化和保存268

（二）其他酶标记物的纯化和保存269

四、半抗原-大分子偶联物的纯化和保存270

第五节偶联物的质量评定271

一、浓度测定271

（一）紫外吸收法272

（二）双缩脲法274

（三）Folin-酚法274

（四）微量凯氏定氮法275

（五）染料结合法275

（六）荧光法276

二、纯度鉴定和结构分析276

三、偶联物中两种分子偶联比率的估算279

（一）分光光度法279

（二）同位素示踪法283

（三）根据偶联物的分子量估算偶联比率284

（四）其他方法284

四、酶标记物中酶活性和免疫活性的测定284

主要参考文献286

第六章用于EIA的非免疫识别物质292

第一节亲和素/生物素系统292

一、亲和素化学本质及理化特性292

二、亲和素的提取和纯化294

（一）从蛋清中提取294

（二）从阿维丁链球菌中提取295

三、亲和素和生物素的含量测定295

四、生物素的活化296

（一）生物素-对硝基苯酯的合成296

（二）生物素-N-羟基琥珀酰亚胺酯的合成298

（三）己酰胺基-BNHS酯的合成299

（四）生物素-重氮苯胺的合成300

（五）生物素-酰肼的制备301

（六）生物素-溴乙酰肼的合成301

五、生物素与蛋白质的偶联301

第二节葡萄球菌A蛋白302

一、基本特性303

（一）SPA的理化特性303

（二）SPA的生物活性304

二、SPA的提取和纯化306

（一）菌种306

（二）细菌的培养307

（三）SPA的提取308

（四）SPA的纯化与纯度鉴定309

三、含SPA葡萄球菌的固相化方法309

（一）TCA热固定法310

（二）福尔马林固定法310

四、SPA与蛋白质（酶）的偶联方法310

（一）SPDP法311

（二）过碘酸钠法311

五、葡萄球菌G蛋白312

（一）基本特性312

（二）SPG与各种动物IgG的结合能力312

第三节凝集素312

一、凝集素的基本特性312

二、ConA的提取和纯化315

三、凝集素酶标记物的制备316

第四节胶固素316

一、胶固素和补体的理化特性和生物学特性317

二、胶固素的提取和纯化318

（一）酵母菌体悬液的制备318

（二）胶固素的提取318

（三）胶固素的纯化319

三、胶固素纯度鉴定和活性测定319

（一）纯度鉴定319

（二）活性测定319

四、胶固素酶标记物的制备320

主要参考文献320

第七章抗原抗体反应动力学和固相化323

第一节抗原抗体反应动力学323

一、抗原抗体反应的理化特性323

二、影响抗原-抗体复合物稳定性的因素325

三、抗体EIA最适工作浓度、滴度和亲和常数测定326

四、抗原-抗体作用动力学332

五、亲合力的概念及其在EIA中的意义333

六、免疫测定中的交叉反应性、特异性和多特异性337

七、酶免疫测定的免疫反应动力学340

（一）AM型酶免疫测定的动力学340

（二）AA型酶免疫测定的动力学344

第二节免疫反应物和非免疫识别物的固相化348

一、固相化的基本原理349

（一）物理吸附349

（二）化学偶联349

二、塑料固相载体的特性和使用350

（一）蛋白质与塑料的相互作用351

（二）抗原与塑料的非共价吸附354

（三）抗体或抗原在塑料上的共价连接357

（四）用桥分子将抗原或抗体连接到塑料载体上360

（五）半抗原的固相化362

（六）塑料固相载体的形状363

三、硝化纤维膜（和纸）载体364

（一）抗原与硝化纤维素膜的斑点连接366

（二）可溶性抗原与硝化纤维素膜的连接367

（三）包被物与纸的共价偶联367

（四）纸的非共价键斑点免疫连接370

四、玻璃固相载体371

五、颗粒固相载体372

六、其他固相载体374

七、影响固相载体固定效果的因素375

（一）固相载体375

（二）被固定物质375

（三）固定（包被）温度与时间376

（四）固定缓冲液377

主要参考文献377

第八章各种EIA方法操作原理和方法及其注意事项381

第一节固相EIA技术382

一、非竞争性固相EIA385

（一）包被抗原的非竞争性EIA方法385

（二）包被抗体或补体的非竞争性EIA391

（三）免疫球蛋白分类捕获方法394

二、竞争性固相EIA395

（一）固定抗体的竞争性EIA395

（二）固定抗原的竞争性EIA397

第二节均质酶免疫测定方法400

一、竞争性均质EIA400

（一）酶标记半抗原的竞争性均质EIA400

（二）用亲和素配位体作酶活性调节剂的均质EIA403

（三）底物标记抗原的均质EIA404

（四）酶标记抗体竞争性均质EIA405

（五）辅因子标记抗原的竞争性均质EIA406

第三节EIA中酶活性的测定407

一、固相EIA中酶活性的测定407

（一）辣根过氧化物酶底物液配制和酶活性测定407

（二）β-半乳糖苷酶活性的测定414

（三）碱性磷酸酶活性的测定414

（四）葡萄糖氧化酶活性的测定415

（五）脲酶活性的测定415

二、均质EIA中酶活性测定415

第四节酶免疫测定新方法415

一、提高灵敏度的新方法416

（一）环式EIA416

（二）酶免疫荧光底物法416

（三）化学发光酶免疫测定417

（四）放射活性底物法418

（五）抗体遮蔽酶尾固相EIA测定419

二、其他实用方法419

（一）测热EIA420

（二）亲和层析EIA420

（三）毛细管免疫迁移EIA421

（四）凝胶扩散EIA421

（五）酶通道免疫测量422

（六）均相酶调节剂调节免疫测定423

主要参考文献423

第九章数据处理与结果表达方法427

第一节定量检测抗体的数据处理和结果表达方法427

一、使用参考血清的意义427

二、检测抗体的结果表达方法429

（一）肉眼观测法429

（二）滴定法429

（三）有效剂量法430

（四）剂量反应曲线标准单位法431

（五）吸光值法432

（六）比值法433

（七）当量活性倍数法434

（八）百分位数估测法437

三、结果可靠性评定437

第二节定量检测抗原或半抗原的数据处理和结果报告方法439

一、标准曲线的建立439

二、标准曲线的拟合和线性化440

（一）A-LogC作图法441

（二）A/A0-LogC作图法441

（三）Logit-Log作图法442

（四）四参数Logitic函数442

三、袖珍计算器在数据统计中的应用446

（一）LogitA/A0数据转移程序446

（二）线性回归程序446

（三）浓度计算447

（四）数据组的平均数及标准差和变异系数计算程序447

（五）计算双份样本均数和标准差及变异系数的程序447

主要参考文献448

第十章EIA质量控制和常见错误分析449

第一节EIA质量控制449

一、质量控制的定义、目的和意义449

二、误差来源与质量控制类别450

（一）误差分类与来源450

（二）质量控制类别451

三、质量控制指标及其影响因素和改进措施451

（一）精密度451

（二）灵敏度457

（三）准确度461

（四）特异性462

（五）稳定性464

四、质量控制的具体方法465

（一）标准曲线的拟合465

（二）样本测定中随机误差的监测及个别坏点的判断和剔除466

（三）系统误差的监测及整批结果的舍弃467

第二节影响标准曲线建立的因素和异常标准曲线的原因分析471

一、影响标准曲线建立的因素及其解决办法472

（一）标准品472

（二）样本中的干扰物质472

（三）反应体系中pH和离子强度473

（四）反应温度和时间473

（五）反应容量474

（六）反应物浓度474

（七）某些特殊样本中的影响因素475

（八）样本贮存476

（九）酶底物系统476

二、异常标准曲线的原因分析476

（一）标准曲线斜率偏低476

（二）标准曲线斜率不变，但最低吸光值偏高或最大吸光值偏低477

（三）标准曲线呈勾变型477

（四）标准曲线上某点或某两点位置漂移478

第三节EIA试剂盒使用中的一些问题478

一、样本吸光值高于标准曲线最大吸光值478

二、样本吸光值低于标准曲线最小吸光值479

三、最大吸光值较低479

四、试剂盒经一次测定后第二次测定中标准曲线不成型的原因479

主要参考文献480

附录482

一、EIA常用缓冲液的配制482

二、Logit N值计算488

三、常用冷冻剂的制备490

四、常用葡聚糖凝胶和生物胶的性质491

五、EIA常用缩略语493

六、常用物质国际单位与重量间的换算503

后记506