《表1 qRT-PCR引物》

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《不同发育阶段小尾寒羊皮肤毛囊特异性miRNA的鉴定》

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U6:内参基因；R+n表示检测到的miRNA序列比已报道miRNA序列在右侧多n个碱基；oar:绵羊；下同U6:Reference gene；R+n means the detected miRNA sequence has n more bases on the right side than the reported miRNA sequence；oar:Ovis aries；The same below

为了验证测序结果的可靠性，对鉴定出的miR-NA进行qRT-PCR验证。以总RNA为初始模板，随机选取6个miRNAs，miRNAs反转录引物为通用颈环序列（GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGG-TATTCGCACTGGATACGAC）和目标miRNA 3'末端6个碱基的反向互补序列构成。使用RevertAid First Strand c DNA Synthesis Kit试剂盒，按照产品说明书进行cDNA第1链合成，使用SYBR?Premix Ex Taq试剂盒进行qRT-PCR验证，U6为内参基因。PCR反应体系（20μL）:SYBR Premix Ex Taq 10μL，上下游引物（10μmol/L）各0.8μL，c DNA模板1μL，ddH2O 7.4μL。PCR反应程序:95℃预变性2 min；95℃变性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，40个循环。miRNA相对表达量结果采用2-ΔΔCt法进行计算。miRNA的qRT-PCR引物见表1。引物由生工生物工程（上海）有限公司合成。