《表1 中华鳖线粒体D-loop区扩增引物及序列》

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《基于线粒体D-loop区序列的中华鳖不同群体遗传差异分析》

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PCR扩增、测序及分析：根据Gen Bank上中华鳖线粒体基因组序列（AY687385.1）设计用于扩增D-loop区的2对引物（表1），送苏州金唯智生物科技有限公司进行合成，用去离子双蒸水将其溶解至浓度为20μmol/L。PCR扩增反应体积为25μL，含模板基因组DNA 100 ng、10×Buffer 2.5μL、2.5mol/L Mg Cl22.0μL、d NTP 1.5μL、上下游引物各1μL、1 U Taq DNA聚合酶，加无菌水补足。PCR反应的循环参数为：94℃预变性2 min；94℃变性45 s，55.3℃退火50 s，72℃延伸90 s，35个循环；72℃延伸10min。将PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳回收纯化后送至苏州金唯智生物科技有限公司直接进行序列测定。为保证序列的准确性，序列经过正反两次重复测定。所获得的序列经校对后，采用DNA-MAN 7.0软件进行序列比对；利用DNAsp 4.0软件统计单倍型及变异位点、计算单倍型多样性（Hd）及核苷酸多样性（π），评价群体遗传多样性水平；用MEGA 5.1软件计算群间和群内的遗传距离，分析碱基组成及核苷酸位点的替换数。