《表4 SAP消化反应程序》

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《PCR-核酸飞行时间质谱系统检测新型冠状病毒方法的建立及应用研究》

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注：-表示无循环

参考美国Agena Bioscience核酸质谱方法建立，检测步骤包括：PCR扩增、虾碱性磷酸酶（SAP）消化、延伸反应、纯化和点样以及飞行时间质谱系统对微阵列芯片进行的信号读取和判别，并对加入模版的量进行优化。根据阳性质粒质谱峰的信噪比（signal-to-noise ratio，SNR）值，形成判断标准：（1)PCR扩增：按表1的比例取出各组分，进行PCR扩增反应液的配制，按照表2的反应程序进行PCR扩增。（2)SAP消化：按表3的比例取出各组分，进行SAP消化反应液的配制，按照表4的反应程序进行SAP消化反应。（3）延伸反应：按表5的比例取出各组分，进行延伸反应液的配制，延伸反应程序为94℃预变性30 s并循环1次，94℃变性5 s、56℃退火5 s并循环5次、80℃延伸5 s（共循环40次），72℃延伸5 min并循环1次，4℃终止反应。（4）纯化：延伸反应完毕后，在产物分析区向每支PCR管/孔延伸产物中加入30μl已混合好的湿树脂，颠倒混匀5 min，5 000 r/min离心1 min，离心半径为11 cm。（5）点样：将纯化后的纯化产物点样到微阵列芯片的基质上。（6）上机检测：使用飞行时间质谱系统对微阵列芯片进行信号读取和判别。