《表1.已报道催化乳糖能够产生乳果糖的纤维二糖差向异构酶》

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《利用纤维二糖差向异构酶制备乳果糖的研究进展》

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CE酶曾被认为是AGE酶（N-乙酰-D-氨基葡萄糖2-差向异构酶、EC 5.1.3.8）家族的成员，但由于AGE酶一般需要ATP参与反应，而CE酶并不需要任何辅酶，且两种酶的序列相似度很低，因此近年来将CE酶单独划为纤维二糖差向异构酶。早在1967年Tyler和Leatherwood就研究了革兰氏阳性菌Ruminococcus albus （白色瘤胃球菌）来源的CE酶，发现它可以催化纤维二糖产生葡萄糖基甘露糖[33]，然而CE酶成为研究热点却是在40多年后。2011年韩国的Park等发现Caldicellulosiruptor saccharolyticus来源CE酶（CSCE）可以催化单糖D-葡萄糖产生D-甘露糖（同时产生副产物D-果糖）[34]，由于D-甘露糖的应用价值，很快CE酶得到了重视。仅一年后通过继续研究，Kim和Oh又发现CSCE酶可以催化乳糖产生乳果糖[20]，自此拉开了CE酶应用于乳果糖合成的序幕。乳糖的溶解度随温度变化很大，其中0°C下溶解度仅为11.9%（W/W），而74°C却达到86.2%（W/W）[35]，这表明高的反应温度可以溶解更多的乳糖，从而提高产物浓度和生产强度。已报道可以产乳果糖的CE酶均具有较高的反应温度，在70–80°C；温度还可以影响CE酶催化醛酮糖异构（乳糖变为乳果糖）和差向异构（乳糖变为依匹乳糖）的产物比例，Park等发现CSCE酶在65°C下的醛酮糖异构活性是37°C下的12倍，而差向异构活性仅为37°C下的27%[36]。因此提高反应温度对高产乳果糖和降低依匹乳糖含量有很大帮助。由表1可知，目前已知的利用纤维二糖差向异构酶催化乳糖得到乳果糖的报道中，都会得到依匹乳糖这一反应副产物，包括Caldicellulosiruptor saccharolyticus、Dictyoglomus turgidum、Dictyoglomus thermophilum、Caldicellulosiruptor obsidiansis等来源（这里均指野生型酶），所产依匹乳糖的含量大约为11%–16%（W/W）[20–24]。依匹乳糖的结构与乳糖和乳果糖都非常相似，属于同分异构体，因此分离极为困难[37]，目前还没有产业化规模下分离成功的报道。为了克服这一困难，Kim等提出在生物催化的过程中添加化学催化剂硼酸，可以使得依匹乳糖的含量降低到2%的水平[38]。其原理是硼酸可以和酮糖（乳果糖）形成络合物，使酮糖脱离反应体系，导致反应平衡向更多酮糖产物生成方向移动。由于依匹乳糖不含酮基，因此在硼酸体系中含量会大幅下降。硼酸的使用也见于D-塔格糖等稀少糖的催化研究中[39]，然而硼酸的使用量较大，而硼是禁止出现在食品中的，因此必须完全去除才能符合法律标准。但作为一种弱酸，想要完全去除非常困难，即使价格昂贵的专用树脂也比较困难，因此这一方法的产业化价值有限。尽管许多糖基异构酶都被证明是金属酶，金属离子对CE酶的活性却没有促进作用，而且经EDTA处理活性也未发生变化，这表明CE酶并不是金属酶[34]。已报道的CE酶热稳定性大多较好，例如Dictyoglomus turgidum CE酶在70°C的活性半衰期达到了55 h[21]。