《表1 目的基因扩增引物：2'-岩藻糖基乳糖的生物合成菌株构建及发酵条件研究》

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《2'-岩藻糖基乳糖的生物合成菌株构建及发酵条件研究》

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注:粗体部分为酶切位点

通过NCBI官网查询fkp和fut C基因序列，根据其基因序列设计引物，fkp基因引入Nde I和Xho I限制性酶切位点，fut C基因引入Nco I和Hind III限制性酶切位点，引物序列fkp-F1/fkp-R1、fut C-F2/fut C-R2见表1。以抽提的B.fragilis和H.pylori全基因组为模板，PCR扩增得到fkp和fut C目的片段。fkp基因的PCR扩增条件为:95℃3 min，95℃15 s，60℃15 s，72℃180 s，循环30次，72℃5 min；fut C基因的PCR扩增条件为:95℃3 min，95℃15 s，58℃15 s，72℃60 s，循环30次，72℃5 min。PCR扩增产物纯化回收后采用酶切位点双酶切、酶连的方法连接质粒载体。构建共表达质粒p CD-fkp-fut C，转化感受态细胞E.coli DH5α，涂布含有链霉素（100μg/m L）抗性的LB固体平板，37℃、200 r/min过夜培养12 h，筛选阳性克隆子，重组质粒p CD-fkp-fut C抽提后进行双酶切验证并测序鉴定。