《表2 ISSR-PCR反应体系各成分优化设计(20μL反应体系)》

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《龙头鱼ISSR-PCR反应体系的建立与优化》

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PCR反应体系为20μL，包括含Mg2+的10×PCR Buffer2μL、d NTPs 1.6μL、引物1.6μL、Taq聚合酶0.2μL、DNA模板8μL，并用双蒸水（13.8μL）补至终体积为20μL。在此基础上，对PCR扩增中4个参数进行体积梯度设置（表2）。参考胡凤荣等[17]和曹冬梅等[18]的研究，将PCR扩增反应程序设置为:95℃预变性4min；94℃变性40s，56.2℃退火45s，72℃延伸90s，30个循环；最后72℃延伸10min，PCR产物4℃保存。每个梯度实验至少重复3次，直至筛选出扩增条带清晰、多态性和重复性好的各因素最优组合。扩增结束后，采用1%琼脂糖凝胶电泳检测并在上海天能（Tanon 2500）全自动数码凝胶图像分析仪上拍照观察。