《表3 PCR所用菌株及引物》

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《膜蛋白基因与抗生素环境适应性的关联研究》

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将敲除载体pNZ5319-0719 Up-Down电击转化到L.plantarum P-8-A-1600后，涂布于浓度均为10μg/mL氯霉素和红霉素MRS固体平板上，筛选出具有氯霉素抗性且不具有红霉素抗性的双交换子，即前后同源臂均进行交换的带有质粒的菌株。用引物0719 upF/0719 downR、EryF/EryR、CatF/CatR进行验证，并以抗生素菌株L.plantarum P-8-A-1600和质粒pNZ5319作为对照。泳道1-3所用引物为EryF/EryR；泳道4-6所用引物为CatF/CatR；泳道7-9所用引物为0719 upF/0719 downR。菌株顺序依次为抗生素菌株L.plantarum P-8-A-1600、质粒pNZ5319和双交换子L.plantarum P-8-A-1600-0719::lox66-P32-cat-lox71。验证结果如图2所示，因为pNZ5319同时具有红霉素基因和氯霉素抗性基因而抗生素菌株和突变株均无红氯霉素抗性，所以泳道2出现条带，而泳道1和3没有出现条带；L.plantarum P-8-A-1600不含红霉素基因和氯霉素基因，因此泳道4没有出现条带，而泳道5和泳道6均出现条带。因为抗生素菌株、质粒和突变株均含有LBP＿cg0719目的基因，所以泳道7-9均有条带出现，而由于质粒pNZ5319和双交换子L.plantarum P-8-A-1600-0719::lox66-P32-cat-lox71与L.plantarum P-8-A-1600相比多了氯霉素抗性基因片段，因此其全长片段要大于L.plantarum P-8-A-1600，在胶图中显示为泳道7的条带要比泳道8和9稍低。PCR产物的测序结果显示各序列均正确。由此可知，已经成功地筛选到了双交换子。