《表1 试验所用菌株、质粒及引物》

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《西瓜噬酸菌调控因子aryR的基因功能分析》

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[注]KmR、ApR、GmR表明分别对卡那霉素、氨苄青霉素和庆大霉素具有抗药性。限制酶位点用下划线标出。

利用Primer 5.0软件根据目的基因aryR左右两端设计引物并扩增目的基因的上下游片段，设计片段引物对LaryR-F/LaryR-R和RaryR-F/RaryR-R，以西瓜噬酸菌Aac-5基因组为模板，扩增目的片段上游和下游片段。通过连接酶将扩增片段与庆大基因（Gm）连接于酶切过后的pK18mobsacB中，构建重组质粒p K18-aryRGm。采用三亲交配的方法将重组质粒导入野生型Aac-5的菌株中。因为质粒pK18mobsacB中蔗糖致死基因的缘故，重组质粒无法在含有蔗糖的培养基上生长。因此在含有抗生素加10%蔗糖的KB平板上，理论上可筛选得到突变株。大量挑取平板中生长的单菌落进行验证，采用果斑病原菌的特异性引物WFB1/WFB2[19]及目的基因的特异性检测引物aryRF/aryRR进行PCR验证。PCR扩增引物序列、酶切位点见表1。