《表1 该研究所用的菌株、质粒和引物》

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《利用人源化酵母系统模拟tomosyn在囊泡运输过程中的功能》

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酿酒酵母出发菌株为Saccharomyces cerevisiae YPH499，质粒及引物相关信息见表1.tomosyn基因以HXO223和HXO224为引物以及人类基因组文库中的tomosyn质粒为模板PCR获得，通过BamHⅠ和XhoⅠ酶切，连接到相同酶切的pRS426GAL1p r载体上pRS426GAL1pr-SGFP2-tomosyn质粒用于表达N端融合SGFP2标签的tomosyn蛋白.为了构建这个质粒SGFP2基因以HXS101和HXS102为引物以及pPICZB-SGFP2[23]为模板通过PCR获得.该基因片段由SpeⅠ和B a m HⅠ酶切并通过相同的酶切位点连接到pRS426GAL1pr-tomosyn质粒上.pRS426GAL1pr-3HA-tomosyn质粒用于表达N端融合3个HA标签的tomosyn蛋白.为了构建这个质粒，3XHA基因以HXS49和HXS50为引物以及pFA6a-3HA-His3MX6[24]为模板通过PCR获得.然后以获得的3XHA片段和HXO224为引物以及pRS426GAL1pr-tomosyn质粒为模板获得3HA-tomosyn基因.该基因片段由SmaⅠ和XhoⅠ酶切并通过相同的酶切位点连接到pRS426GAL1pr质粒上Sso1/187K-STX1AD133V基因通过融合PCR获得.第一步，以HXS78和HXO19为引物及人类大脑cDNA为模板PCR获得从189K这个氨基酸开始的syntaxin的SNARE区域.第二步，以第一步PCR产物和HXO15为引物及YPH499基因组为模板PCR获得融合C端SSO1区域的189K这个氨基酸开始的syntaxin的SNARE区域.第三步，以HXO14和第二步PCR产物为引物及pRS314-SSO1pr-Sso1/STX1AD133V质粒为模板通过PCR获得Sso1/187K-STX1AD133V基因片段.该基因片段通过SpeⅠ和XhoⅠ连接到pRS314-SSO1pr质粒上获得pRS314-SSO1pr-Sso1/187K-STX1AD133V质粒.AD-SSO1，-STX1A，-Sso1/187K-STX1AD133V，-Sso1/STX1AD133V，-C1，-C2D133V及BD-tomosyn质粒为酵母双杂交实验所需质粒，为了构建这些质粒，SSO1，Sso1/187K-STX1AD133V，Sso1/STX1AD133V，C1和C2D133V基因以HXS319和HXS320为引物，以314-SSO1，-Sso1/187K-STX1AD133V，-Sso1/STX1AD133V，-C1，-C2D133V质粒为模板，通过PCR获得.STX1A及tomosyn基因分别以HXS122和HXS126及HXS124和HXS125为引物，以人类大脑cDNA及pRS426GAL1pr-tomosyn为模板，通过PCR获得.SSO1，STX1A，Sso1/187K-STX1AD133V，Sso1/STX1AD133V，C1和C2D133V基因通过EcoRⅠ和XhoⅠ酶切位点连接到pGADT7 AD载体上，tomosyn基因通过BamHⅠ和SalⅠ酶切位点连接到pGBKT7载体上.