《表1 q RT-PCR使用的引物列表》

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《博莱霉素诱导小鼠肺纤维化中差异表达的mRNA及其与LncRNA的共表达网络关系》

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针对每一个需要测量的基因和管家基因，选择确定表达该基因的c DNA模板进行PCR反应，配置反应体系（2×Master Mix 5μL，10μmol/L的PCR特异引物F0.5μL，10μmol/L的PCR特异引物R 0.5μL，c DNA 2μL加水至总体积为10μL），引物序列见表1，轻弹管底将溶液混合，5000 r/min短暂离心，设置PCR反应：95℃，10 min；40个PCR循环（95℃，10 s；60℃，60（收集荧光））。PCR产物与100 bp DNA Ladder在2%琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，检测PCR产物是否为单一特异性扩增条带。将PCR产物进行10倍梯度稀释：设定PCR产物浓度为1，分别稀释为1×10-1，1×10-2，1×10-3，1×10-4，1×10-5，1×10-6，1×10-7，1×10-8，1×10-9，这几个梯度浓度的DNA。将所有c DNA样品分别配置Realtime PCR反应体系。将8μL混合液加到384-PCR板对应的每个孔中。再加入对应的2μL c DNA。小心粘上Sealing Film封口膜，并短暂离心混合。在设置PCR程序前将准备好的PCR板放在冰上。将上述384-PCR板置于Realtime PCR仪上进行PCR反应。所有的指标均按以下程序进行：95℃，10 min；40个PCR循环（95℃，10 s；60℃，60 s（收集荧光））。为了建立PCR产物的熔解曲线，扩增反应结束后，按（95℃，10 s；60℃，60 s；95℃，15 s）；并从60℃缓慢加热到99℃（仪器自动进行-Ramp Rate为0.05℃/s）。各样品的目的基因和管家基因分别进行Realtime PCR反应。根据绘制的梯度稀释DNA标准曲线，各样品目的基因和管家基因的浓度结果直接由机器生成。每个样品的目的基因浓度除以其管家基因的浓度，即为此样品此基因的校正后的相对含量。