《表1 16S r RNA及sec A1基因PCR扩增引物及产物大小》

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《河北地区多中心临床分离诺卡菌菌种分布》

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参照文献[5-6]合成16S r RNA和sec A1基因扩增引物，引物序列见表1，由上海生工公司合成。PCR反应体系为50μL，包括2×Es Taq Master Mix 25μL，上、下游引物（10μmol/L）各2μL，DNA 4μL，dd H2O 17μL。PCR反应条件:95℃5 min；95℃15 s，56℃20 s，72℃20 s，35个循环；72℃7 min。产物经10 g/L琼脂糖凝胶电泳观察。PCR反应产物经纯化送上海生工公司采用3730XL DNA测序仪进行Sanger双向测序。序列与NCBI的基因库进行BLAST比对，根据CLSI MM18-A[7]，若16S r RNA序列与模式菌相似度≥99.0%，且与其他种相似度之差大于0.8%，鉴定为种；若相似度<99.0%或相似度≥99.0%且与其他种相似度之差小于0.8%，则进行sec A1序列分析与模式菌相似性达到≥99.0%鉴定到种。