《表1 巢式PCR扩增肺炎支原体23S rRNA基因引物及产物大小》

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《成人社区获得性肺炎患者分离的肺炎支原体对大环内酯类药物耐药性和机制研究》

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注:F为上游引物、R为下游引物；F1与R1构成外套引物、F2与R2构成内套引物。

将1 ml临床分离Mp菌株和M129标准株培养液置1.5 ml离心管10 000 r/min离心10 min，取沉淀加入50μl裂解液，充分混匀后，100℃水浴10 min，12 000 r/min离心5 min，上清液即为DNA模板。引物设计参考Genbank已报道的肺炎支原体23S rRNA基因（NC＿000912）[10]，具体见表1，委托上海Invitrogen公司合成引物。PCR总体积为100μl，外套扩增体系组成:引物F1和R1各250 nmol/L、各d NTP 2.5 mol/L、2.5 U Ex-Taq DNA聚合酶（Ta KaRa）、5μl DNA模板、1×PCR缓冲液（p H=8.3）。PCR参数:93℃2 min；93℃1 min，50℃1 min，72℃1 min，35个循环；72℃5 min。完成每次扩增后，以第一次扩增产物为模板，用F2和R2为引物，其余组成与外套PCR完成内套扩增，并用1μg/ml溴乙锭预染色的2.0%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，预期产物大小为244 bp。对电泳结果出现目的条带的PCR产物进行纯化并送委托上海Invitrogen测序。