《表1 mi RNA-455-5p、PIK3R1、AKT1及MTOR合成的引物序列》

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《miRNA-455-5p对人结肠癌HT-29细胞株PIK3R1基因靶向调控作用的研究》

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采用q RT-PCR法。将收集的细胞沉淀反转录到cDNA，用sybr染料法进行PIK3R1、AKT1、MTOR mRNA表达的检测。（1）RNA抽提：对样本进行组织研磨、贴壁细胞洗涤、悬浮细胞去培养基等处理后，置于RNaseFree的1.5ml离心管中；加入1 000μl Trizol试剂，剧烈摇晃，静置5min；加200μl氯仿，振荡混匀，室温静置5min；12 000g、4℃离心15min；将上清液转移至新的1.5ml离心管中，加入等体积的异丙醇，室温静置10min；12 000g、4℃离心10min；弃上清液，除尽异丙醇，加入1 000μl75%无水乙醇，12 000g、4℃离心5min；弃上清液，待沉淀干燥后加入DEPC处理水30～50μl；RNA电泳和OD检测质检。（2）引物合成：miRNA-455-5p、PIK3R1、AKT1及MTOR合成的引物序列，见表1。（3）调整RNA浓度，按照实验目的稀释RNA至统一浓度；取一灭菌的无RNA酶的eppendorf管，每个样本加入以下组分，得到MixⅠ共20μl体系：5μg总RNA 5μl，rimer（50μM oligo dT）0.5μl，andom primer 0.5μl，0mM dNTP Mix 1μl，EPC-treated water 5μl；在MixⅠ里加入以下成分，得到MixⅡ共20μl体系：5xFirst-Strand buffer 4μl，0.1M d TT2μl，Naseout（40U/μl）1μl，SuperScripⅢRT（200U/μl）1μl，MixⅠ12μl。反应条件：25℃5min，50℃60min，70℃15min。（4）将获得的引物与cDNA模板进行扩增，反应体系：ddH2O 23μl，10×PCR Buffer 2.0μl，Mg2+（50mM）2.0μl，dNTPs（10mM）0.5μl，Primer F（10μM）0.5μl，SYBR（20×）1.0μl，Primer R（10μM）0.5μl，Taq enzyme（5U/μl）0.2μl，Template 1.0μl，总体积20μl。每个样本反应总量20μl，反应条件：95℃2min，95℃10s，60℃60s，70℃45s，共40个循环；Melt（70～95℃）。采用2-ΔΔCt法计算mRNA相对表达量，ΔΔCt=待测样品（Ct目-Ct内）-对照样品（Ct目-Ct内）。