《表1 PCR扩增反应体系》

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《小麦重要生育期和入仓阶段籽粒真菌污染及呕吐毒素积累情况分析》

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（1）真菌DNA基因组提取：采用热裂解法[6]，用无菌接种针挑取少量菌丝放到盛有100μL超纯水的1.5 m L离心管中，涡旋振荡1 min，充分混匀。10 000 rpm离心30 s，用微量移液器小心弃去上清液。在离心管中加入100μL裂解液，封口膜封口后放入金属浴85℃，20～30 min。粗提物中含有真菌的基因组DNA，放入-20℃保存备用。（2）裂解液成分：50 mmol/L的磷酸二氢钠，1 mmol/L的EDTA（乙二胺四乙酸）和5%甘油，调节pH值到7.4，使用前121℃高压蒸汽灭菌20 min，4℃储藏备用。（3）核糖体DNA中ITS序列扩增[7]：基于18S核糖体DNA的内转录间隔区（Internal Transcribed Spacer，ITS）的通用引物，ITS1:5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’和ITS4:5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’，进行PCR扩增，反应体系见表1。反应条件：95℃预变性3 min；94℃变性1 min、55℃退火1min、72℃延伸1 min共计35个循环；72℃延伸10 min。扩增结束于4℃保存备用。（4)PCR产物检测：将扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳，观察是否有目的条带，将产物送往青岛擎科测序公司进行测序。（5）系统发育分析：对返回的测序结果用Geneious 8.0.3软件进行序列分析和校正，得到的高质量DNA序列上传到美国国家生物技术信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）数据库的Genebank中进行同源序列Blast比对，寻找具有较高同源性的核苷酸序列，初步确定其发育地位，并下载相似度高的菌种序列及序列号。将各类菌株序列和比对结果导入Mega 7.0软件进行多序列比对（alignment）分析，采用最大似然法（Maximum Likelihood，ML）构建系统发育树。