《表5 PCR扩增反应体系》

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《富士苹果MSAP优异分析系统的建立及应用初探》

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注:DNA-01:酶连产物10倍稀释液；DNA-02:预扩产物20倍稀释液

采集同一时间同样苗龄的13份富士苹果叶片，CTAB法提取DNA（程运江等，2001）。Eco RⅠ、HpaⅡ（MspⅠ）接头及引物序列参考Vos等（1995）和Xiong等（1999）（表3） 。MSAP实验前，先对2个单链的接头复性为双链，反应条件:100℃5 min，缓慢冷却至室温，-20℃冷冻保存备用。限制性酶切和连接采用“一步法”同时进行（表4），各反应成分用量基本参考张美善（2007），反应程序为:37℃8 h，65℃10 min。MSAP-PCR预扩和选择性扩增反应体系参照Du等（2009），略有所调整（表5），预扩反应程序:94℃4 min，94℃30 s，56℃1 min，72℃1 min，28 cycles，72℃10 min；选扩反应程序:94℃4 min；94℃40 s，65℃1 min，72℃1 min 1个循环；第2至第13个循环，DNA退火温度每次递减0.7℃，其余步骤同第1个循环；94℃40 s，56℃1 min，72℃1 min，24个循环；72℃延伸8 min。两种方式检测PCR终产物:1.5%的琼脂糖预检测；6%聚丙烯酰胺变性胶，银染法显色显影。引物序列合成于上海生工生物工程技术服务有限公司；PCR反应相关试剂均购于大连宝生物；内切酶为NEB产品。