《表1 PEDV S基因和ORF3基因特异引物序列》

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《猪流行性腹泻病毒变异株GDqy2017的分离及S和ORF3基因序列分析》

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PEDV的分离参考Hoffmann M等[4]建立的方法，稍做修改，具体如下:按常规方法培养Vero细胞，传入6孔板，待其长至单层且状态良好，弃去培养液，PBS洗板2次，将上述处理好的病毒液用细胞培养液DMEM稀释5倍，500μL/孔传入6孔板，轻轻晃动，使病毒液均匀覆盖细胞表面，将6孔板置于37℃、体积分数为5%CO2的培养箱中孵育1h，期间晃动数次，1h后取出培养板，弃去病毒液，PBS洗板1次，加入含10μg/mL胰酶的DMEM培养液2mL，再次置于培养箱培养，每天观察，待其出现明显细胞病变（cytopathic effect，CPE）或者培养至7d，收毒，记为第1代，置于-70℃保存或者反复冻融3次，在Vero细胞中继续传代培养。1.2.5 S基因和ORF3基因序列克隆及测序根据GenBank收录的PEDV CV777全基因组序列设计特异引物（引物序列见表1），扩增分离毒株的S基因和ORF3基因全序列，电泳结果为阳性的PCR产物，进行纯化并克隆测序。