《表1 qRT-PCR相关基因引物序列》

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《花鲈cox6a基因与相关miRNA的鉴定及其在盐度适应中的表达调控分析》

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用RNAiso Plus和RNAiso for Small RNA（日本TaKaRa）提取总RNA和总miRNA。分别用核酸测定仪（Biodropsis BD-1000，北京OSTC）和电泳仪检测RNA的浓度和完整性。使用PrimeScriptTM RT试剂盒（日本TaKaRa）去除总RNA中的基因组DNA并反转录成cDNA。使用DNase I酶（日本TaKaRa）去除总miRNA中的基因组DNA，并用Mir-XTM miRNA First-Strand Synthesis试剂盒（日本TaKaRa）反转录合成cDNA。使用StepOne Plus Real-Time PCR system（Applied Biosystems）PCR仪，对cox6a1、cox6a2、miR-223、miR-200a-3p、miR-155-5p以及miR-30e-5p进行qRT-PCR检测。反应体系总体积为20μL，包含2μL cDNA模板，正向和反向引物各0.4μL，10μL SYBR?FAST qRT-PCR Master Mix、0.4μL ROX Dye和6.8μL ddH2O。qRT-PCR反应程序如下:95℃预变性5 s，95℃变性5 s，60℃退火30 s，共40个循环。mRNA定量以18S RNA为内参，基因特异性引物使用Primer 5软件设计，引物信息详见表1。miRNA定量中的上游引物为特异性引物，下游引物为通用引物，以U6为内参，其上游引物为5′-TGGAACGCTTCACGAATTTGCG-3′，下游引物为5′-GGAACGATACAGAGAAGATTAGC-3′。其他引物信息见表2。基因及miRNA的相对表达量采用2–ΔΔCt法进行计算。