《表1 七个管家基因引物序列》

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《重庆某三甲医院耐碳青霉烯类弗劳地枸橼酸杆菌感染危险因素分析及分子流行病学调查》

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注:F-上游序列R-下游序列

采用MLST对32株CRCF进行分型。煮沸法提取细菌DNA模板；（1）引物设计:网站上获得弗劳地枸橼酸杆菌的7个管家基因引物序列，详见表1（http://pubmlst.org/cfreundii/）；（2）反应体系:总反应体积25μl，DNA 2μl，引物各0.75μl，TaKaRa r Taq DNA poly-merase 12.5μl，灭菌纯水9.0μl；（3）反应条件:95℃预变性5 min，95℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃1 min，30个循环，72℃延伸10 min；PCR扩增产物经琼脂糖电泳分离，凝胶成像观察结果。PCR扩增产物送由上海生工生物工程股份有限公司测序，测序结果在弗劳地枸橼酸杆菌MLST数据库进行比对得到每个管家基因的等位基因号，将七个管家基因按aspC-clpX-fadD-mdh-arcA-dnaG-lysP顺序排列形成等位基因谱，与数据库中已有等位基因谱进行比对，得到每株细菌的ST型（http://pubmlst.org/cfreundii/）。