《表2 沙门菌七对管家基因的引物序列》

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《禽沙门菌分离鉴定方法的建立与优化》

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（1） MLST引物设计：参考MLST官方网站（http://mlst.Warwi ck.ac.uk/mlst/dbs/Senterica）上公布的七对管家基因的片段序列（aroC，dnaN，hemD，hisD，purE，sucA，thrA），并由睿博兴科生物技术有限公司合成所需引物。引物序列见表2。（2）细菌DNA的提取：参考细菌基因组DNA提取试剂盒说明书提取沙门菌分离株的DNA。（3) PCR反应条件：PCR扩增体系为50μl，其中2×PCR Master Mix（含有2×Taq DNA聚合酶、2×PCR Buffer和2×dNTP）25μl、DNA模板2μl、上下游引物（10pmol/μl）各2μl、ddH2O 19μl。反应程序：94℃5min（预变性），94℃45s，55℃45s（退火），72℃1min，共35个循环，72℃7min（延伸），4℃结束。（4) PCR产物纯化：将PCR产物全部用于电泳检测，用1%琼脂糖凝胶电泳，电压120V，电泳45min，以DNA Marker DL2000为参照用凝胶成像仪成像观察，并将有目的片段的琼脂凝胶切下，装到预先准备好的离心管中，然后参考胶回收试剂盒说明书继续PCR产物的纯化。（5）测序及结果分析：将上述纯化后的PCR产物交于上海生物工程技术有限公司进行测序。下载沙门菌管家基因全部数据库，然后建立本地数据库，对测序结果剪切后进行序列比对，记录七对管家基因的等位基因数值，然后通过Pub MLST网站查询ST型。