《表1 gyr A和par C基因PCR引物序列及产物长度》

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《氟喹诺酮耐药肠球菌gyrA和parC基因突变特征及其与环丙沙星耐药相关性分析》

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将实验收集的所有肠球菌和质控菌株粪肠球菌ATCC29212提取细菌基因组DNA后，进行gyrA和par C耐药基因PCR扩增和基因测序检测。参考文献[8]设计肠球菌gyrA和par C基因特异性引物（表1），委托北京索莱宝科技有限公司合成引物。PCR采用25μl反应体系：上下游引物（10μM）各1μl，2×Master Mix 12.5μl，DNA模板（200 ng/μl）2μl，dd H2O 8.5μl。反应条件：94℃预变性3 min；94℃变性30 s，50-55℃退火30 s（见表1），72℃延伸1 min，35个循环；最后72℃延伸5 min。采用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，gyrA和par C基因扩增片段大小分别为241 bp和191 bp，使用XRS+化学发光凝胶成像仪检测目的条带。采用柱离心式DNA产物纯化试剂盒对PCR扩增产物进行纯化，并委托苏州协云基因科技有限公司进行扩增产物正反双向测序。测序结果在Genebank（www.ncbi.nlm.nih.gov）进行BLAST序列分析，使用Nucleotide BLAST程序进行核酸序列多重比对分析，使用TBLASTx程序进行氨基酸序列多重比对分析。此外，测序结果的gyrA、par C序列分别与文献报道[10]的屎肠球菌gyrA(Gen Bank NO:AF0608811）和par C(Gen Bank NO:AB017811）序列进行比对分析。