《表1 引物序列：过表达miR-202对甲状腺癌细胞恶性表型的影响及作用机制》

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《过表达miR-202对甲状腺癌细胞恶性表型的影响及作用机制》

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2.研究方法:（1）细胞培养:甲状腺癌细胞系TPC-1和8505C购自中国科学院细胞库。所有细胞均在含有10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素溶液的RPMI-1640培养基中培养（均购自美国Gibco公司），于37℃、5%CO2的细胞培养箱中培养。（2）细胞转染:用miR-202阴性模拟物和miR-202模拟物分别转染对数生长期的TPC-1细胞，分别命名为NC-1组和mimics-1组；用miR-202阴性模拟物和miR-202模拟物分别转染对数生长期的8505C细胞，分别命名为NC-2组和mimics-2组；对miR-202模拟物成功转染的TPC-1和8505C细胞，进行ROCK1表达载体转染，命名为mimics+ROCK1组。所有转染均使用Lipofectamine 2000（美国Invitrogen公司），操作严格按照Lipofectamine 2000说明书进行。（3）实时荧光定量聚合酶链式反应技术（quantitative real time polymerase chain reaction，qRT-PCR实验）:使用TRIzol试剂（美国Invitrogen公司）提取组织中的总RNA，使用逆转录试剂盒（美国Invitrogen公司）合成互补DNA（cDNA）。qRT-PCR实验采用20μl反应系统，其中cDNA（1μl），正向引物（1μl）和反向引物（1μl）。扩增反应过程为变性（95℃，10s）、退火（60℃，20s）和延伸（72℃，30s）三个步骤。扩增循环数为40，采用2-ΔΔCt分析数据。以U6为内参。miR-202和U6引物序列见表1。（4）双荧光素酶报告实验:通过靶扫描检测ROCK1是否为miR-202的直接靶基因，并确定靶结合位点。基于结合位点设计ROCK1靶序列，通过PCR反应扩增该片段并插入到psi CHECK-2载体中。miR-202目标序列，包括突变和野生（MT和WT）序列，也分别插入到psi CHECK-2报告载体中。miR-202模拟物与mt-psiCHECK-2报告载体或wt-psiCHECK-2报告载体分别使用Lipofectamine 2000试剂共转染TPC-1和8505C细胞，培养48h后，通过双荧光素酶报告基因检测系统（北京普洛麦格公司）检测各组细胞的荧光素酶相对表达强度。（5）CCK8实验:经过0、12、24和36h培养，将装有细胞的96孔板取出并在每个孔中加入10μl CCK8溶液和90μl的细胞培养基，后将细胞在37°C下避光孵育1h，450nm波长下测定各孔吸光度（OD450值）。（6）Caspase-3酶联免疫吸附试验（武汉华美公司）:将细胞反复冻融破坏细胞膜后，离心取上清。取100u样品加入预包被Caspase-3抗体的酶标板，孵育30min，加入辣根过氧化物酶标记的抗Caspase-3抗体，后用底物显色，酶标仪测定OD450值。