《表1 引物序列：氯硝柳胺对斑马鱼幼鱼甲状腺内分泌系统的影响》

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《氯硝柳胺对斑马鱼幼鱼甲状腺内分泌系统的影响》

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RNA提取、纯化和定量以及cDNA合成和目的mRNA的表达检测按照文献[16]方法。氯硝柳胺暴露120 h后，从每个处理组中分别取约30条幼鱼在低温条件下充分匀浆，用Trizol抽提总RNA，逆转录为cDNA，再以cD-NA为模板加入目标基因的上下游引物进行PCR扩增。本次主要检测与甲状腺激素调节相关的促甲状腺素β（tshβ）和甲状腺激素转运蛋白（ttr）两个重要基因表达水平，对照组和每个暴露浓度组中均设置4个平行样（30条/平行样），每个样品2个重复。采用在线引物设计软件（http://frodo.wi.mit.edu/）设计引物序列（表1）。在进行m RNA检测之前，我们评估了常用的5个内参基因（rpl8、18s、β-actin、gapdh和efl1α）在氯硝柳胺暴露下转录的稳定性，选取氯硝柳胺暴露时最稳定的β-actin作为内参基因。实时荧光定量PCR反应体系为：cDNA模板2.0μL，2×荧光染料预混液12.5μL，上、下游引物（10μmol/L）各1.0μL，ddH2O8.5μL。反应条件为：95℃变性3 min；95℃30 s，60℃15 s，72℃45 s，共40个循环。反应结束后绘制溶解曲线用于检测是否有非特异产物。根据2-ΔΔCt方法计算目的基因mRNA表达量。