《表1 LC3B突变蛋白原核表达载体构建引物》

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《SDSL-EPR技术检测LC3B蛋白功能结构域中特定位点的运动特性》

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引物a和d的下划线处分别为NdeⅠ和NotⅠ酶切位点

通过序列重叠延伸PCR(sequence overlapped extension PCR，SOE-PCR）方法引入Cys点突变：以pGEX-KG-LC3B为模板，进行PCR扩增，扩增条件为：95℃、5 min→95℃、46 s，62℃、46 s，72℃、46 s(38个循环）→72℃、7 min→4℃保存；扩增产物加入10×核酸上样缓冲液，1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定及切取目的条带，按凝胶回收试剂盒说明书所述步骤进行回收；通过a、b引物（表1）实现上链突变，c、d引物实现下链突变；以突变后的上、下链为模板，用a、d引物实现双链突变，最终获得含有点突变的目的基因序列。将突变后的目的基因序列和pET-22b质粒分别进行NdeⅠ和NotⅠ双酶切，37℃水浴酶切2 h，1.5%琼脂糖凝胶电泳回收。酶切产物和载体经T4连接酶16℃过夜连接。将连接产物转入BL21(DE3）感受态细胞，挑选阳性单克隆接种到含氨苄青霉素的LB液体培养基中过夜培养并提取质粒，送北京博迈德生物公司测序。