《表1 CD146、VEGF、VEGFR2及GAPDH的引物序列》

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《CD146在聚乙二醇诱导的小鼠脉络膜新生血管模型中的表达及意义》

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从视网膜下注射后第5、10、15天组分别随机选取9只小鼠，采用过量1%戊巴比妥钠麻醉处死后，使用弯镊迅速将眼球完整取出后放置于FAS眼球固定液中固定1 h，使用PBS将眼球冲洗干净将其置于盛有少量PBS的玻璃皿中。在解剖显微镜下，剪去视神经和眼外肌筋膜。用有齿镊夹住角膜，使用眼科剪沿角巩膜缘将角膜剪去，去除晶状体，使用镊子将视杯巩膜与神经视网膜完整分离，操作中注意动作轻柔，尤其在分离视网膜下注射部位时，由于病变部位神经视网膜与脉络膜粘连紧密，更需谨慎操作，避免机械性损伤。神经视网膜分离完毕后用刮匙轻轻刮下RPE/脉络膜复合体，连同分离好的神经视网膜分别放入标记好的EP管中，每个EP管中加入1 mL Trizol Reagent后，超声匀浆，按照说明书提取组织总RNA。采用Nanodrop分光光度计测定总RNA的浓度，OD260 nm/OD280 nm比值在1.8～2.0的样本纯度较高，可选用进行下一步逆转录反应，不达标的样本将剔除本实验。按照Takara反转录试剂盒说明书将m RNA逆转录成cDNA，并进行实时荧光定量PCR，总反应体积为20 m L。PCR的反应条件如下：预变性（95℃10 min，循环1次）；PCR反应（95℃变性15 s，60℃预变性退火、延伸1 min，共循环40次）。通过2-△△Ct法计算基因的相对表达量，使用GADPH作为内参基因，且本实验所有引物序列均由北京擎科新业生物技术有限公司合成并检测，引物序列详见表1。