《表2 实时荧光定量PCR引物信息》

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《冷却治疗对劳力性热射病大鼠肾脏AQP2 mRNA及蛋白表达的影响》

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（1）蛋白抽提：预冷RIPA蛋白抽提试剂，加入蛋白酶抑制剂（cocktail）；4℃离心（12000 rpm×15 min）。取上清液。（2)BCA法蛋白定量：按照BCA蛋白定量试剂盒（北京康为世纪）使用说明操作，测定蛋白浓度。（3)Western Blot实验：取待检测蛋白样品进行电泳分离（浓缩胶恒压电泳：90 V，约20 min；分离胶恒压150 V，通过预染蛋白marker来确定电泳停止时间）。采用湿转法将蛋白转至PVDF膜，100 V恒压，60min。将膜浸没于5%BSA-TBST中，水平摇床孵育1 h（RT）。一抗孵育：5%BSA-TBST稀释一抗（AQP2，1︰500；GAPDH，1︰1000，Abcam公司），4℃水平摇床孵育过夜。次日，TBST洗膜：3×10min。二抗孵育：5%BSA-TBST稀释二抗（山羊抗兔IgG(H+L），HRP，1︰10000，Abcam公司），室温孵育1 h。TBST洗膜：3×10 min。将ECL发光液滴加到膜的蛋白面，反应3～5 min。胶片曝光：10 s～5 min，显影2 min，定影。（4）计算结果：采用Image J软件计算蛋白条带灰度值，以目的蛋白与内参蛋白灰度值的比值作为目的蛋白相对表达量。