《表1 RETN、LEPR和ADIPOQ基因引物序列》

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《RETN、LEPR和ADIPOQ基因多态性与中国汉族人群2型糖尿病风险及血脂代谢的关系》

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注：F1、F2、F3为等位基因特异性引物；R为通用反向引物

采用竞争性等位基因特异性PCR（kompetitive allele specific PCR，KASP）技术，自动化设计SNP分型的等位基因特异性引物和通用反向引物，引物序列见表1，由北京一道生物科技有限公司合成。具体实验步骤如下：(1）DNA质检和浓度测定：取1μL置于百泰克ND5000超微紫外可见分光光度计测量，质检合格后的DNA样本方可进行后续的分型实验，质控标准：DNA浓度>20 ng/μL，纯度OD260/OD280=1.6～2.0。（2）DNA均一化处理：质检合格的DNA进行稀释，终浓度是5 ng/μL。（3）PCR反应：取2μL DNA，在55℃45 min烘干，然后配置混合物（mix)，3μL体系，需要2×KASP master mix（北京梓熙生物科技有限公司）及引物mix，mix由浓度是100 pmol/μL的F1:F2:R=1:1:2.5的比例混合，引物mix占反应体系的1/72。（4）参比荧光检测：PCR反应体系配好以后，在ABI 7900荧光定量PCR仪上进行预读，然后在ABI 9700 PCR仪再进行PCR反应，94℃5 min，94℃20 s，61℃1 min，共10个循环，降落PCR每次降落0.6℃；94℃20 s，55℃1 min，共26个循环；最后72℃1 min。（5）终荧光检测：PCR完成后，在ABI 7900荧光定量PCR仪上进行后读出，通过SDS2.4进行基因分型和判读。