《环境化学物致突变、致畸、致癌试验方法》求取 ⇩

1 概论1

短期试验2

一组试验的必要性3

试验项目的选择5

2 鼠伤寒沙门氏菌营养缺陷型回复突变试验(Ames试验)13

菌株的基因型及生物学特性的测试18

操作19

组氨酸缺陷型(his~-)19

深度粗糙突变(rfa)——结晶紫抑菌试验20

氨苄青霉素/四环素平板20

R因子——抗氨苄青霉素试验21

AuvrB突变——紫外线敏感试验22

自发回复突变(his~+)23

回变特性——诊断性试验23

测试菌株的保藏和应用24

常用试剂及培养基的配方26

常用试剂26

营养肉汤29

营养肉汤琼脂培养基29

改良Vogel—Bonner(V—B)10E29

顶层软琼脂30

最低营养V—B培养基30

组氨酸/生物平板30

氨苄育霉素平板30

0.5mM L—组氨酸/0.5mM D—生物系溶液31

0.2M磷酸钠缓冲液31

哺乳动物肝S9的制备及应用31

诱导方法和S9的制备32

合并诱导方法32

S9混合液的配制34

受试化学物35

诱变试验操作与结果判断35

溶剂35

斑点试验(Spot test)与阳性判断依据36

平板掺入试验车阳性判断标准37

假阳性与假阴性38

平板掺入试验的发展40

预培养法40

干燥器内试验法40

尿中诱变剂的俭出41

其他辅助因子的补给41

波动试验42

菌株42

试剂、贮存液及培养液的配制42

操作程序45

试验结果的统汁评价46

安全预防措施48

附录48

肝匀浆S9组分蛋白质含量测定48

肝匀浆S9组分细胞色素P—450测定51

细胞色素P—450芳烃羟化酶(AHH)活性测定52

3 大肠杆菌营养缺陷型回复突变试验56

菌株57

菌株基因型鉴定58

色氨酸需要58

乳糖、硫胺素需要59

△uvrA/B——紫外线敏感试验59

R因子——氨苄青霉素敏感试验60

回变特性60

自发回变61

菌种保藏62

悬液深低温63

主要培养基和溶液的配制63

营养肉汤培养基、营养肉汤琼脂培养基、半固体培养基、Davis—Mingioli盐液的配制63

20％葡萄糖水溶液63

20％乳糖水溶液63

5mg％硫胺素水溶液63

0.1％L—色氨酸水溶液63

10％酪蛋白水解物水溶液63

定期移植63

选择培养基顶层64

选择培养基底层64

4倍稀释D—M盐溶液65

生长培养液65

肝微粒体的应用65

检品的配制和预试65

试验方法66

点试及操作步骤66

平板掺入法及操作步骤67

对本试验的评价69

平板掺入法69

数据处理与结果分析69

点试法69

4 大肠杆菌DNA聚合酶缺陷型修复试验73

菌株的性状鉴定和菌种保藏75

培养基和溶液的配制76

HA＋T琼脂培养基76

贮存盐溶液77

肝微粒体的应用77

HA＋T液体培养基77

HA＋T软琼脂培养基77

受试物的配制和对照试剂78

试验方法78

标准纸片扩散法及其操作步骤78

平板掺入法及其操作步骤80

液体法及其操作步骤80

结果判断和数据处理82

对本试验的评价83

5 枯草杆菌重组缺陷型重组试验87

特性鉴定89

菌种保藏89

培养基和溶液的配制90

B—2肉汁培养基90

B—2肉汁琼脂培养基90

“干燥”平板制备90

改良的Schaeffer培养基90

B—2肉汁软琼脂培养基91

50％(W/V)甘油水溶液91

M/15磷酸盐缓冲液91

缓冲盐溶液91

肝微粒体在试验小的应用92

受试物的配制和对照试剂的选择92

试验方法93

划线法93

芽胞法95

液体法96

结果判断和数据处理98

菌株的性状鉴定和菌种保藏98

对本试验的评价101

6 哺乳类细胞DNA损伤的检测105

原理110

碱性蔗糖梯度沉降试验110

操作步骤112

碱性洗脱试验116

原理116

操作步骤117

7 哺乳类细胞DNA修复反应的检测125

DNA损伤的切除修复及其检测125

等密度梯度沉降试验128

原理128

操作步骤129

溴尿嘧啶光解试验133

原理133

操作步骤135

程序外DNA合成(UDS)试验138

原理138

UDS放射自显影显示法的操作步骤140

UDS液体闪烁计数显示法的操作步骤143

原理148

实验步骤148

DNA合成抑制试验148

8 哺乳类细胞诱变试验153

野生型细胞的选择154

CHO细胞系155

V79细胞系155

L5178Y细胞系155

人二倍体成纤维细胞155

常用基因座位的特征155

h9prt座位156

质膜Na~+/K+ATP酶座位(乌本苷耐受性)157

tk座位158

白喉毒素耐受座位(dip~r)159

实验设计模式和影响实验结果的因素159

自发突变率160

突变表现型的“表达时间”161

代谢协同作用与选择时的细胞密度161

集落分裂162

其他162

V79(CHO)/hgprt系统163

几个哺乳类细胞诱变试验系统163

V79/oua~r系统166

HF/dip~r系统166

L5178Y(tk~+/tk~-)/tk系统168

9 细胞转化试验173

SHE细胞转化试验175

SHE细胞的分离及冷冻贮存176

检测步骤177

C3H/1CT1/2及BALB/C—3T3细胞系系统183

检测步骤184

细胞系的培养和贮存184

BHK—21/软琼脂系统187

BHK—21/C1—?3的培养条件188

检测步骤189

·附录·细胞培养基本技术190

10 体细胞染色体畸变试验195

体外染色体畸变的试验199

细胞株的测试199

人外周血细胞染色体畸变试验202

取样时间203

给药次数、途径与剂量203

动物选择203

体内骨髓细胞染色体畸变试验203

制片步骤204

染色体畸变分析206

染色体数目的变化206

染色体结构的变化207

11 微核试验218

哺乳动物骨髓嗜染红细胞(PCE)微核试验220

细胞群的选择220

动物选择220

剂量及分组221

给药方式及制片时间222

对照组224

制片方法224

染色225

嗜多染红细胞及微核计数227

数据处理228

结果评价228

哺乳动物骨髓嗜多染红细胞微核试验的优缺点229

原理230

胚胎转移微核试验230

试验方法231

讨论232

其他细胞微核试验233

哺乳动物减数分裂细胞的微核试验233

肝细胞微核试验234

细胞培养微核试验234

小鼠睥脏微核试验234

外周血微核试验234

与SCE同时进行微核试验235

12 姊妹染色单体交换试验236

原理237

哺乳类细胞体外SCE试验238

哺乳类动物体内SCE试验240

实验设计240

BUdR的预处理240

操作步骤242

统计处理及结果评价245

SCE方法的优缺点246

SCE的基线频率246

13 睾丸染色体畸变试验249

精子发生过程250

试验方法252

动物252

给药剂量及途径252

精原细胞畸变观察253

初级精母细胞畸变观察253

精子畸形试验与致癌性的关系263

14 精子畸形试验264

动物265

给药和剂量265

对照265

精子采样与检查265

精子畸形试验方法265

统计分忻与评价266

精子畸形与诱变性的关系267

特异座位试验267

可遗传易位试验267

显性致死试验267

小鼠精子畸形试验的灵敏度和特异性268

精子试验的优缺点269

有待进一步研究的问题270

15 显性致死试验272

原理272

试验方法273

动物选择273

剂量、动物分组及给药方式273

交配方法275

结果统计分析277

胎仔检查277

结果判断278

讨论279

16 果蝇伴性隐性致死试验282

试验方法282

原理282

果蝇284

预试285

阳性和阴性对照286

样本的大小286

给予受试物287

交配程序288

结果的判断、统计处理及评价289

结果的判断标准289

统计处理及评价289

注意事项290

对方法学的评价290

应用及发展概况291

17 致畸试验与生殖毒性试验294

有关致畸的基本概念296

致畸性296

胚胎毒性296

母体毒性296

畸形和畸胎发生296

致畸指数296

影响畸胎发生的因素和致畸机理296

发育阶段297

遗传的感受性297

化学物的剂量298

化学物的理化性质298

致畸机理299

美国的生殖毒性试验规范299

FDA的两代生殖试验结合致畸试验300

FDA的三代生殖试验结合致畸试验302

FDA的致畸试验要点302

FDA的三段致畸试验305

EPA的禽类生殖试验307

大鼠致畸试验308

我国的生殖毒性试验方案308

喂养生殖试验结合致畸试验308

生殖毒性试验的发展310

18 诱癌试验312

实验动物312

动物种属和品系的选择312

动物的需要量313

动物的饲养管理314

经口给药316

经皮肤给药316

给药途径316

腹腔内注入317

静脉内注入317

呼吸道给药317

预备试验318

急性试验318

两周重复给药试验318

亚慢性试验318

动物随机分组320

诱癌试验实施方法320

动物的自发性肿瘤320

给药剂量和实验时限323

日常观察和处理324

病理学检查324

诱癌试验结果的评价325

肿瘤的发生率325

诱癌试验阳性的判断标准325

提高诱癌试验敏感性的措施326

经胎盘诱癌试验326

新生动物中诱癌327